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1、PCR 技术必须有人工合成的合理引物和提取的样品 DNA，然后才进行自动热循环，最后进行产物鉴定与分析。引物设计与合成目前只能在少数技术力量较强的研究院、所进行，临床应用只需购买 PCR 检测试剂盒就可开展工作，PCR 自动热循环中影响因素很多，对不同的 DNA 样品，PCR 反应中各种成份加入量和温度循环参数均不一致。现将几种主要影响因素介绍如下。 一、温度循环参数一、温度循环参数在 PCR 自动热循环中，最关键的因素是变性与退火的温度。如操作范例所示，其变性、退火、延伸的条件是：9460s, 3760s, 72120s，共 2530 个循环，扩增片段500bp。在这里，每一步的时间应从反应
2、混合液达到所要求的温度后开始计算。在自动热循环仪内由混合液原温度变至所要求温度的时间需要 3060s，这一迟滞时间的长短取决于几个因素，包括反应管类型、壁厚、反应混合液体积、热源（水浴或加热块）以及两步骤间的温度差，在设置热循环时应充分给以重视和考虑，对每一仪器均应进行实测。关于热循环时间的另一个重要考虑是两条引物之间的距离；距离越远，合成靶序列全长所需的时间也越长，前文给出的反应时间是按最适于合成长度 500bp 的靶序列拟定的。下面就各种温度的选择作一介绍。1模板变性温度变性温度是决定 PCR 反应中双链 DNA 解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链 DNA 模板，PCR 也就不会启动
3、。变性温度低则变性不完全，DNA 双链会很快复性，因而减少产量。一般取 9095。样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度。DNA 变性只需要几秒种，时间过久没有必要；反之，在高温时间应尽量缩短，以保持 Taq DNA 聚合酶的活力，加入 Taq DNA 聚合酶后最高变性温度不宜超过 95。2引物退火温度退火温度决定 PCR 特异性与产量；温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA 扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。一般先由 37反应条件开始，设置一系列对照反应，以确定某一特定反应的最适退火温度。也可根据引物的（G+C）%含量进行推测，把握试验
4、的起始点，一般试验中退火温度 Ta(annealing temperature)比扩增引物的融解温度 TTm(melting temperature)低 5，可按公式进行计算：Ta = Tm - 5= 4(G+C)+ 2(A+T) -5其中 A，T，G，C 分别表示相应碱基的个数。例如，20 个碱基的引物，如果（G+C）%含量为 50% 时，则 Ta 的起点可设在 55。在典型的引物浓度时（如 0.2mol/L）,退火反应数秒即可完成，长时间退火没有必要。3引物延伸温度温度的选择取决于 Taq DNA 聚合酶的最适温度。一般取 7075，在 72时酶催化核苷酸的标准速率可达 35100 个核苷
5、酸/秒。每分钟可延伸 1kb 的长度，其速度取决于缓冲溶液的组成、pH 值、盐浓度与 DNA 模板的性质。扩增片段如短于150bp，则可省略延伸这一步，而成为双温循环，因 Taq DNA 聚合酶在退火温度下足以完成短序列的合成。对于 100300bp 之间的短序列片段，采用快速、简便的双温循环是行之有效的。此时，引物延伸温度与退火温度相同。对于 1kb 以上的 DNA 片段，可根据片段长度将延伸时间控制在 17min，与此同时，在 PCR 缓冲液中需加入明胶或 BSA 试剂，使 Taq DNA 聚合酶在长时间内保持良好的活性与稳定性；15%20%的甘油有助于扩增 2.5kb 左右或较长 DNA
6、 片段。4循环次数常规 PCR 一般为 2540 个周期。一般的错误是循环次数过多，非特异性背景严重，复杂度增加。当然循环反应的次数太少，则产率偏低。所以，在保证产物得率前提下，应尽量减少循环次数。扩增结束后，样品冷却并置 4保存。二、引物引物设计二、引物引物设计要扩增模板 DNA，首先要设计两条寡核苷酸引物，所谓引物，实际上就是两段与待扩增靶 DNA 序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离决定扩增片段的长度，两引物的 5端决定扩增产物的两个 5末端位置。由此可见，引物是决定 PCR 扩增片段长度、位置和结果的关键，引物设计也就更为重要。引物设计的必要条件是与引物互补的靶 DNA 序列必须是已知
7、的，两引物之间的序列未必清楚，这两段已知序列一般为 1520 个碱基，可以用 DNA 合成仪合成与其对应互补的二条引物，除此之外，引物设计一般遵循的原则包括：1引物长度根据统计学计算，长约 17 个碱基的寡核苷酸序列在人的基因组中可能出现的机率的为 1 次。因此，引物长度一般最低不少于 16 个核苷酸，而最高不超过 30 个核苷酸，最佳长度为 2024 个核苷酸。这样短的寡核苷酸在聚合反应温度（通过 72）下不会形成稳定的杂合体。有时可在 5端添加不与模板互补的序列，如限制性酶切位点或启动因子等，以完成基因克隆和其他特殊需要；引物 5端生物素标记或荧光标记可用于微生物检测等各种目的。 有时引物
8、不起作用，理由不明，可移动位置来解决。2（G+C）%含量引物的组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中（G+C）%含量应尽量相似，在已知扩增片段（G+C）%含量时宜接近于待扩增片段，一般以 40%60%为佳。3引物内部应避免内部形成明显的次级结构，尤其是发夹结构（hairpin structures）。例如：4引物之间两个引物之间不应发生互补，特别是在引物 3端，即使无法避免，其 3端互补碱基也不应大于 2 个碱基，否则易生成“引物二聚体”或“引物二倍体”（Primer dimer）。所谓引物二聚体实质上是在 DNA 聚合酶作用下，一条引物在另一条引物序列上进行延伸所形成的与二条引
9、物长度相近的双链 DNA 片段，是 PCR 常见的副产品，有时甚至成为主要产物。另外，两条引物之间避免有同源序列，尤为连续 6 个以上相同碱基的寡核苷酸片段，否则两条引物会相互竞争模板的同一位点；同样，引物与待扩增靶 DNA 或样品 DNA 的其它序列也不能存在 6 个以上碱基的同源序列。否则，引物就会与其它位点结合，使特异扩增减少，非特异扩增增加。5引物 3端配对 DNA 聚合酶是在引物 3端添加单核苷酸，所以，引物 3端 56 个碱基与靶 DNA 的配对要求必须精确和严格，这样才能保证 PCR 有效扩增。引物设计是否合理可用 PCRDESN 软件和美国 PRIMER 软件进行计算机检索来核
10、定。人工合成的寡核苷酸引于最好经过色谱（层析）纯化或 PAGE 纯化，以除去未能合成至全长的短链等杂质。纯化引物在 25%乙腈溶液中 4保存可阻止微生物的生长；一般情况下，不用的引物应保存在-20冰箱中，在液体中引物能保存 6 个月，冻干后可保存 12 年。三、三、DNA 聚合酶聚合酶早在 1956 年 Kornberg 等就从大肠杆菌提取液中发现了 DNA 聚合酶，并且得到了 DNA 聚合酶 纯品。DNA 聚合酶是由分子量为 109000 的一条多肽链构成，此酶可被枯草杆菌蛋白酶分解为两个片段，一个片段分子量为 76000，有聚合酶活性，并有 35 外切酶活力，即 Klenow 片段（Kle
11、now fragment）。另一个片段分子量为 34000，具有 53外切酶活力。因此，DNA 聚合酶具有几种功能：一是聚合作用，以 DNA 为模板，将 dNTP 中的脱氧单核苷酸逐个加到 3-OH 末端。二是有35外切酶活力，能识别和消除错配的引物末端，与复制过程中校正功能有关。三是 53 外切酶活力，它能从 5端水解核苷酸，还能经过几个核苷酸起作用，切除错配的核苷酸。1985 年 Mullis 等发明了 PCR 方法，以 Klenow 片段完成 -珠蛋白的 PCR 后，世界上许多实验室就考虑用耐热 DNA 聚合酶代替 Klenow 片段进行 PCR，使耐热多聚酶的研究得以迅速发展。人们从生
12、活于 60（B.Stearothermophilus）到 87（S.Solfatavicus）的许多菌中分离纯化出耐热 DNA 聚合酶，但有些酶不能耐受 DNA 变性所需温度，所以无法应用于 PCR。现就 PCR 反应中常用的 DNA 聚合酶等作一详细介绍。1Taq DNA 聚合酶用 Taq DNA 聚合酶代替大肠杆菌 DNA 聚合酶的 Klenow 片段是使PCR 普及应用的关键。Klenow 片段不能耐受 95的双链 DNA 变性温度，所以每次循环都要加入新酶；而 Taq DNA 聚合酶可以耐受 9395的高温，避免了不断补加多聚酶的繁琐操作，同时使退火和延伸温度得以提高，减少了非特异性产
13、物和 DNA 二级结构对 PCR 的干扰，增进了 PCR 特异性、产量和敏感度，二者相比，其主要区别在于：Klenow酶的最适温度为 37，扩增的产物并非全是目的序列，需用探针检测。Taq 酶则不仅产率高而特异性也高。它的最适温度为 7475。因而使退火温度可以提高，使退火严格性提高，减少错配引物的延伸。循环后期酶量渐感不足而产生平坡。到达平玻的循环次数，Klenow 酶为 20 个（均用 1g 基因组 DNA 开始）而 Taq 酶为 30 个。延伸片段长度 Taq 酶为 10kb 以内，而 Klenow 酶为 400bp 以内。 Taq 酶由水栖高温菌（Thermus aquatics）YT
14、1 蓖株中分离而得。此菌于 1969 年由Brock 分离自美国黄石公园温泉，作为栖热杆菌的标准菌株，其生长温度为 7075。最初从中分离到分子量 6068KDa，比活性为 20008000U/mg 的 DNA 聚合酶。后来 Cetus 公司的 Kary Mullis 等又分离到比活为 20 万 U/mg 的纯酶，分子量为 93910。此种 9.4KDa 酶的最适温度为 7580，与单纯核苷酸的结合率（Kcat）可达 150 核苷酸（nt）/s酶分子。以 M13模板，用富含 G+C 的 30bp 引物延伸，70时 Kact60nt/s；55可达 24nt/s；37时为 1.5nt/s，而 22
15、时低至 0.25nt/s。高于 90时 DNA 合成活性甚差，这种高温条件下，引物与模板已不能牢固结合。在 PCR 反应混合液中，Taq 酶于 92.5,95及 97.5保持其 50%活力的时间分别为 130、40 及 56min，在 50 次循环的 PCR 中当管内最高温度为 95。每循环为 20s时尚可保持 65%活力。Taq 酶在 95的半寿期为 40min，故在 PCR 循环中选用的变性温度，不宜高于 95。Taq 酶现已可用基因重组的方法生产，商品名为 Ampli Taq（Cetus 公司）。Taq 酶的完整基因长 2499bp，在大肠杆菌中表达生产，含 832 个氨基酸。在氨基酸序
16、列上与大肠杆菌 DNA 聚合酶有 38%是一致的，包括对 dNTP 结合，引物与模板作用区均存在于Taq 酶中。Taq 酶具有依赖 DNA 合成的 53外切酶活性，因此，模板上有一段退火的 3-磷酸化的“阻断物”，会被逐个切除而不会阻止来自上游引物链的延伸，而对于 5-32P 标记的合成寡核苷酸引物，则无论是单链或是与模板复性，都未发现降解，所以该种活性不会影响PCR 结果。Taq 酶没有 35外切酶活性，如果发生 dNTP 错误掺入，这种酶没有校正能力，因此运用 Taq 酶进行 PCR，产物中点突变较多，对克隆等不太有利。一般错掺率为 1.2510-4110-5(4dNTPs 浓度分别为 200mol/L，Mg2+为 1.5mmol/L，在 55退火)。但不含 35外切酶活性对测序有利。2影响酶活力的因素 Taq 酶的活力受 Mg2+离子的影响。用
