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1、基金项目基金项目：国家 863 高技术研究发展计划(2007AA10Z404) 收稿日期收稿日期：2009-9- 作者简介作者简介：于彩虹（1973） ，女，副教授,主要从事环境微生物、生物化工方面的研究工作。Email:两株乙酰甲胺磷降解菌的分离鉴定及降解特性两株乙酰甲胺磷降解菌的分离鉴定及降解特性 研究研究于彩虹1 张显涛1 宋英男1 张帅1 路兴波2 孙红炜2 *（1.中国矿业大学（北京）化学与环境工程学院，北京 100083；2. 山东省农业科学院植物保护研究所，山东 济南 250100）摘要：摘要：利用富集及驯化培养方法，从长期生产农药的企业废水处理系统及厂房周边的污染土壤和池水中，
2、分离筛选出两株能够高效降解乙酰甲胺磷的菌株 Y3、Y6。在形态特征和生理生化鉴定的基础上，对其 16S rDNA 序列进行了分析，并重点研究了它们对乙酰甲胺磷及其它农药的降解特性和抗性。结果表明，Y3、Y6 分别为寡养单胞菌（Stenotrophomonas）和假单胞菌（Pseudomonas） 。Y3、Y6 在乙酰甲胺磷浓度分别为 500 mgL-1和 1000 mgL-1，培养温度 30，初始 pH 8.0，接种量为 2.5%条件下，一周内可以将 80%左右的乙酰甲胺磷矿化为磷酸根。外加葡萄糖及酵母膏对降解效率的研究表明，当酵母膏含量为 1gL-1时，降解效果最理想；而外加葡萄糖的量，会相
3、对抑制农药的降解。抗性实验显示，Y3、Y6 均可在较高浓度的其它有机磷类及氨基甲酸酯类农药的普通培养基中生长，对其它农药的抗性也比较广泛。植物侵染实验显示，Y3、Y6 对试验中的豆科、禾本科、十字花科及葫芦科植物不具备致病性，说明 Y3、Y6 环境安全性较强。关键词：关键词：乙酰甲胺磷；菌株；降解特性Isolation, identification and degradation characteristics of two acephate-degrading bacteriaYu Caihong Zhang Xiantao1 Song Yingnan1 Lu Xingbo2 Sun Ho
4、ngwei2 *(1.School of Chemical and Environmental Engineering, China University of Mining and Technology(Beijing), Beijing 100083;2.Institute of Plant Protection, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100)Abstract: In this study, by the method of enrichment and domestication, we isolated
5、 two strains of bacteria 2designated as Y-3 and Y-6, respectively, from the wastewater treatment system of the pesticide enterprise as well as the soil and water around its workplace. The traditional morphology, physio-biochemical characteristics and 16S rDNA gene sequence analysis were applied to t
6、he bacteria classification. The characteristics of degrading acephate and the resistance of any other pesticides were also studied. The results showed that strains Y-3 and Y-6 were identified as Stenotrophomonas sp and Pseudomonas sp. With the initial acephate concentration 500 and 1000 mgL-1, the i
7、nitial pH value 8.0, 30, the ratio of bacteria suspension (OD600=2)2.5%, the completely degradation rates were both about 80%. The study also demonstrated that the optimum content of the yeast extract was 1gL-1 , while the content of the glucose inhibits the degradation of acephate. The resistance e
8、xperiments showed that, Y-3 and Y-6 could also be found in higher concentrations of other types of organic phosphorus and carbamate pesticides in the general growth medium, which have more extensive pesticide resistance. Plant infection experiments showed that, Y-3 and Y-6 almost do not have any pat
9、hogenicity on the Leguminosae, Gramineae, Cruciferae and Cucurbitaceae plants, safe to the environment.Key Words: acephate; strain; degradation characteristics乙酰甲胺磷(Acephate)又名高灭磷，化学名称为 O,S-二甲基乙酰基硫代磷酰胺酯，是杀虫剂甲胺磷的 N-乙酰基衍生物，分子量 183.16，结构式为：乙酰甲胺磷是一种高效、低毒、低残留、持效期长、内吸性强的广谱性有机磷杀虫剂。从 2007年 1 月 1 日起， 中国已全面禁止
10、在农业生产中使用甲胺磷、对硫磷、甲基对硫磷、久效磷、磷胺等5 种高毒农药， 乙酰甲胺磷作为替代高毒农药的一种主打产品而广泛应用于我国蔬菜、果树和水稻等作物的害虫防治 1 。2007 年乙酰甲胺磷在中国的产量仅有 4000 吨，近年来起产量逐年剧增，有望成为万吨农药品种2。虽然，人们一直认为乙酰甲胺磷是一种低毒农药，对环境安全性高，被广泛用于粮食、蔬菜和水果生产中，但近年来在中国很多地区的蔬菜、茶叶及海鲜产品的农药残留检测中都发现乙酰甲胺磷的残留超标问题3,4,5,6,7，研究表明乙酰甲胺磷在菠菜中代谢较慢，30%的乙酰甲胺磷采用 1100ml/hm2的施药量在 15 天后，仍能够检测到乙酰甲胺
11、磷的残留8。乙酰甲胺磷易溶于水，在土壤中易淋溶，易对水体造成污染，在莱州湾海域部分地区能检测到的乙酰甲胺磷含量较高9。而且乙酰甲胺磷在植3物和动物体内很容易被代谢成毒性更高的甲胺磷。最新的水生物毒理学研究表明，亚致死浓度的乙酰甲胺磷对萼花臂尾轮虫实验种群动态具有显著的影响。随着乙酰甲胺磷在中国的大量生产和使用，相关农药废水的处理、食品和环境中乙酰甲胺磷的残留等问题会越来越突出，并且农药给环境带来的副作用在使用后很长时间才能显现出来。因此，如何降低乙酰甲胺磷的污染和残留问题变得日益重要。土壤中的有机污染物主要是依靠微生物降解，所以利用生态系统中微生物代谢类型的多样性、生化适应能力的极强性以及能迅
12、速产生相应酶系的应急性，来快速降解各类人工合成的农药，使其完全矿化成无机物，是目前最有潜力最有效的研究方法之一10,11。而迄今为止，人们对于乙酰甲胺磷的微生物降解菌的研究较少。因此，分离筛选具有高效降解乙酰甲胺磷农药的微生物，对消除农药污染、净化环境及社会的可持续发展具有重要的现实意义。所以本研究的目的是从农药污水处理池中采样，通过富集和驯化培养，获得以乙酰甲胺磷为唯一碳源的高效代谢菌株，对其进行菌种鉴定，并测定降解特性及致病性。1 材料与方法材料与方法1.1 试验材料试验材料1.1.1 培养基培养基（均加 1L 蒸馏水，农药适量添加）液体富集培养基：牛肉膏 3g, 蛋白胨 10g, NaC
13、l 5g 液体驯化培养基：NaNO3 1.0g, NaCl 0.5g, K2HPO4 1.5g, KH2PO4 0.5g, (NH4)2SO4 0.5g, MgSO40.5g, 酵母膏 0.5g （可加入 15g 琼脂制成驯化平板划线分离）降解测定培养基：KNO3 1.0g，(NH4)2SO4 0.5g，KCl 0.5g，酵母粉 0.05g1.1.2 药品与试剂药品与试剂92%的乙酰甲胺磷原药（取自山东华阳农药集团） ，其它试剂均为分析纯（购自北京中北林格生物科技有限公司） 。1.1.3 样品采集样品采集采自山东华阳农药集团厂房周边，以及厂区污水处理系统曝气池曝气泵周围的土样、水样，该厂长期生
14、产有机磷杀虫剂及其它各类农药。1.2 菌种的富集与驯化菌种的富集与驯化对取到的样品先进行富集培养，起初选择药液的浓度为 50mg/L，以周为单位更换培养基并逐步提高农药选择液的浓度（具体时间以富集效果而定，有时适当延长富集培养的时间） 。当富集培养液中的选择液浓度至少达到 500mg/L 后，转入驯化培养基培养。配备相应的固体培养基平板，驯化过程涂布观察以及划线分离。将得到的菌株在一般环境下，粗测降解效率较高的两株菌命名为 Y3、Y6，作为重点研究对象，并用甘油液封，-20保藏。常用待测的菌种置于乙酰甲胺磷为 5000mg/L 的斜面培养基 5保藏。1.3 两株降解细菌的鉴定两株降解细菌的鉴定
15、1.3.1 生理生化特性测定生理生化特性测定按照微生物学实验12，对筛选到的 2 株细菌进行革兰氏染色、过氧化氢酶、淀粉水解、尿4素反应、硝酸盐还原与糖醇利用等生理生化特性以及温度、pH 值适应范围及耐盐性的测定。1.3.2 16S rDNA扩增、序列测定及同源性比较扩增、序列测定及同源性比较菌株基因组的鉴定采用 16S rDNA 序列分析的方法。使用细菌基因组 DNA 提取试剂盒提取Y3,Y6 的基因组 DNA，以此为模版 PCR 大量扩增各菌的 16S rDNA 序列。PCR 扩增正向引物为 F：5-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3；反向引物为 R：5-GGC TA
16、C CTT GTT ACG ACT T-3。PCR 反应程序：94预变性 5min，94变性30s，54退火 50s，72延伸 1.5min，30 个循环，72延伸 8min。然后用 1%琼脂糖电泳检测 PCR产物。得到的 16S rDNA 序列扩增产物用 DNA 回收纯化试剂盒纯化后由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。测得的序列登陆 NCBI 网站，通过 Blast 程序与 Genbank 中核酸数据进行比对分析构建系统发育树。1.4 乙酰甲胺磷降解量的检测乙酰甲胺磷降解量的检测使用钼蓝比色法13，直接测定反应后培养液中磷酸根离子的质量，从而间接确定细菌直接矿化乙酰的量。菌种在降解测定培养基内培养一段时间，取 1mL 反应后培养液定量稀释加入 50mL 的容量瓶内，然后加入 5ml 钼酸铵溶液和 3ml 抗坏血酸溶液，用水稀释至刻度,摇匀。于室温下放置10min 后测定其 OD720的值，对照标准工作曲线，求出 50mL 容量瓶内 PO43-的
