巴西绿蜂胶胶囊总黄酮的测定

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1、第 6 卷 第 8 期 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 Vol. 6 No. 8 2015 年 8 月 Journal of Food Safety and Quality Aug. , 2015 *通讯作者: 李跃彬, 高级食品检验员, 主要研究方向为保健食品的质量检测。E-mail: *Corresponding author: LI Yue-Bin, By-Health Co., Ltd., Zhuhai 519040, China. E-mail: 巴西绿蜂胶胶囊总黄酮的测定 李跃彬*, 俞金标, 吴斯燕, 植爱萍 (汤臣倍健股份有限公司, 珠海 519040) 摘摘 要要

2、: 目的目的 建立以石油醚洗脱杂质测定巴西绿蜂胶胶囊中总黄酮的方法。方法方法 样品经乙醇提取, 用聚酰胺粉吸附, 分别用石油醚、 苯不同溶剂洗去杂质; 经甲醇洗脱后, 在波长 360 nm 处, 用分光光度法测定巴西绿蜂胶中总黄酮的含量。结果结果 采用石油醚作为洗脱剂, 总黄酮含量在 1.989723.8761 g/mL 范围 内 , 与 吸 光 度 值 呈 良 好 的 线 性 关 系 , 浓 度 -吸 光 度 回 归 方 程 为 Y=0.02976X-0.00741, 相 关 系 数r2=0.99954。方法精密度为 1.0%, 平均回收率为 96.5%。与用苯洗脱杂质结果比较, 两者无显著

3、性差异。结论结论 该方法操作简便, 重现性及稳定性好, 线性范围宽, 减少了苯对检测人员和环境的污染, 可用于保健食品中总黄酮的测定。 关键词关键词: 总黄酮; 苯; 石油醚(3060) Determination of total flavonoids in Brazil green propolis capsule LI Yue-Bin, YU Jin-Biao, WU Si-Yan, ZHI Ai-Ping (By-Health Co., Ltd., Zhuhai 519040, China) ABSTRACT: Objective To establish a method for d

4、etermining flavonoids in Brazil green propolis capsule. Methods The total flavonoids in Brazil green propolis capsule were determined by spectrophotometry after the samples were distilled by methanol and purified by petroleum ether. The detection wavelength was 360 nm. Results The calibration curve

5、of flavonoids content and absorbance had a good linearity in the range of 1.989723.8761 g/mL (r2=99954). The relative standard deviations were 1.0%, and the recoveries were 96.5%. The results had no obvious difference which purified by petroleum ether instead of benzene. Conclusion The method is sim

6、ple, stable and accurate, and it can be applied successfully to determine flavonoids in health food. KEY WORDS: total flavonoids; benzene; petroleum ether(3060) 1 引 言 自然界中发现的黄酮类化合物有 2700 多种。这些物质都是以C6-C3-C6为基本骨架, 或与醇、 糖结合, 或以游离形态存在。 根据中间碳原子的成环及氧化取代的不同, 它们可分为黄酮类化合物、异黄酮类、类黄酮三类, 总称总黄酮。 现在很多蜂胶产品进行质量控制的就是

7、总黄酮的总量1。 通常方法有硝酸铝比色法和直接紫测定法。汤臣倍健的蜂胶软胶囊采用巴西进口原料巴西绿蜂胶, 选择直接紫外测定法保健食品检验与评价技术规范2, 但是, 该测定方法中需以苯洗脱杂质, 苯的毒性很强, 对环境极易造成污染, 并对实验者造成永久性伤害。因此本文用石油醚替代苯, 实验结果与用苯洗脱得到的结果无显著性差异。 第 8 期 李跃彬, 等: 巴西绿蜂胶胶囊总黄酮的测定 3061 2 材料与方法 2.1 仪器与试剂 芦丁对照品(纯度: 92.6%, 来源: 中国食品药品检定研究院, 批号: 100080-201409); 95%乙醇 (分析纯, 广州化学试剂厂); 甲醇(分析纯, 广

8、州化学试剂厂); 石油醚(沸程:30 60 , 分析纯, 广州化学试剂厂; 20140801-2); 苯(分析纯, 广州化学试剂厂); 聚酰胺粉(国药集团化学试剂有限公司)。 UV-2450 型紫外分光光度计(岛津(中国)有限公司); XA-204 分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司); 层析柱(0.9 cm30 cm)。 2.2 实验方法 2.2.1 标准曲线绘制 总黄酮(以芦丁计)标准溶液: 称取 5.0 mg 芦丁, 加甲醇溶解并定容至 100 mL, 即得 50 g/mL。吸取芦丁标准溶液: 0、 1.0、 2.0、 3.0、 4.0、 5.0 mL 于 10 mL容量瓶中,

9、 加甲醇至刻度, 摇匀, 于 360 nm 比色, 计算回归方程。 图 1 标准曲线图 Fig. 1 The standard curve 由图 1 可以看出, 溶液中总黄酮在 1.989723.8761 g/mL 之间呈良好的线性关系, 浓度-吸光度回归方程 Y=0.02976X-0.00741, 相关系 r2=0.99954。 2.2.2 样品制备与测定 称取 0.5 g 样品内容物至 50 mL 量瓶中, 加乙醇约 40 mL, 60 超声 2 h 至样品完全松散, 充分提取; 冷却, 定容至刻度, 摇匀并离心后吸取澄清液1.0 mL, 加入称有 1 g 聚酰胺粉的蒸发皿中吸附, 105

10、 挥干乙醇, 然后转入层析柱。用 20 mL 石油醚进行洗脱, 用甲醇洗脱并收集洗脱液, 定容至 50 mL。在波长360 nm 处测定吸收值计算回归方程, 计算样品中总黄酮含量。 3 结果与分析 3.1 不同实验方法对结果的影响 根据 2.2.2, 分别验证不同洗脱剂、不同洗脱体积、不同超声时间对蜂胶黄酮含量的影响, 以得出最安全有效提取黄酮含量的方法。 3.1.1 不同洗脱剂对实验结果的影响 由表1结果表明, 分别用石油醚和苯作为洗脱剂洗脱杂质, 以石油醚作洗脱剂, 总黄酮含量为 2.67%; 以苯作洗脱剂, 总黄酮含量为 2.67%, 通过 t 检验、F检验, t=0, 所以以石油醚、苯

11、作为洗脱剂洗脱杂质结果没有显著性差异, 因此可以用石油醚代替苯洗脱杂质。 表 1 不同洗脱剂对实验结果的影响(n=6) Table 1 Effect of different elution agents on the experimental result (n=6) 1 2 3 4 5 6 RSD%石油醚2.65 2.652.632.71 2.66 2.70 1.2 苯 2.66 2.702.712.68 2.64 2.65 1.1 3.1.2 不同体积洗脱剂对实验结果的影响 样品总黄酮的理论含量为: 2.7%2.8%, 由表 2结果表明, 用 50 mL 体积甲醇洗脱, 总黄酮含量为2.

12、7%, 接近理论值; 25 mL 体积甲醇洗脱, 总黄酮含量为 2.3%, 明显低于理论含量; 100 mL 体积甲醇洗脱, 总黄酮含量为 2.7%, 与 50 mL 体积甲醇洗脱效果一致, 所以 50 mL 体积洗脱较为合理。 表 2 不同体积洗脱对实验结果的影响(n=6) Table 2 Effect of different volume elution on the experimental result (n=6) 1 2 3 4 5 6 平均值 50 mL2.712.682.652.72 2.64 2.692.70.0325 mL2.322.282.312.26 2.41 2.40

13、2.30.06100 mL2.722.692.662.70 2.65 2.672.70.033062 食品安全质量检测学报 第 6 卷 3.1.3 不同超声时间对实验结果的影响 由表 3 结果表明, 样品超声 1 h、1.5 h, 总黄酮含 量 分 别 为 : 2.3% 、 2.6%, 均 低 于 理 论 含 量2.7%2.8%; 超声 2 h、3 h, 总黄酮含量均为 2.8%, ,结果接近理论值; 为提高检验效率, 样品的超声时间确定为 2 h, 既可以使样品充分被提取出来, 又可以节省检验时间。 表 3 不同超声时间对总黄酮的影响 Table 3 Effect of different

14、ultrasonic time on total flavonoids 时间(h) 测定结果(%) 平均值1 2.32 2.31 2.29 2.30.021.5 2.60 2.62 2.61 2.60.012 2.82 2.81 2.79 2.80.023 2.83 2.80 2.82 2.80.023.2 方法学验证 3.2.1 精密度实验 平行称取6份样品, 按样品的制备与测定方法测定样品中总黄酮的含量, 见表 4。 表 4 精密度实验(n=6) Table 4 The precision of the experiment (n=6) 称样量(g) 测定结果(%) 平均值(%) RSD(

15、%) 0.5794 2.76 2.7 1.0 0.5652 2.75 0.6032 2.74 0.6031 2.71 0.6544 2.70 0.5991 2.70 由表 4 可以看出, 总黄酮的平均含量为 2.7%, 相对标准偏差: RSD=1.0%, 说明实验结果的重复性良好。 3.2.2 回收率实验 向样品分别添加 80%、100%、120%不同量的芦丁标准品, 且每个加标梯度进行 3 次平行样实验, 按样品的制备与测定方法测定加标样品中总黄酮的含量, 计算回收率, 见表 5。本方法的回收率为 96.5%, RSD 为 0.7%, 说明本方法具有良好的准确度。 表 5 回收率实验 Tab

16、le 5 The standard addition recovery of the experiment (n=9) 加标量 (g) 测得加标量 (g) 回收率 (%) 平均回收率 (%) RSD (%)4.5917 4.4589 97.10 96.5 0.7 4.5917 4.4753 97.46 4.5917 4.4101 96.04 5.1319 4.9012 95.50 5.1319 4.9756 96.95 5.1319 4.9472 96.40 6.1568 5.9178 96.11 6.1568 5.9541 96.70 6.1568 5.9453 96.56 4 讨 论 4.1 波长选择 黄酮类化合物是母体结构为二苯基色酮的一类化合物的总称, 包括: 黄酮、黄酮醇、脱氢黄酮、异黄酮和查耳酮等, 这一类化合物有两个