《细胞培养方法介绍》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细胞培养方法介绍（1页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1091081.将200 mL培养物从培养箱转移到生物安全柜中，静置使微载体沉降下来。避免细胞长时间缺氧。2.微载体沉降后，吸出培养基。3.向转瓶中加入50-100 mL Thermo Scientific HyClone Dulbecco s磷酸盐缓冲液（DPBS），无钙镁离子（SH30028.03），充分清洗载满细胞的微载体，注意不要让液体大力冲击微载体，以免把细胞冲掉。a.室温下以40 rpm的转速搅拌培养物 约15分钟。4.将第二次清洗用的DPBS除去后，加入25mL（或少一些）的胰蛋白酶（SH30236）或HyQTase非哺乳动物细胞分离试剂（SV30030.01），40 rpm搅拌
2、培养物15分钟。（可根据实际温度调整时间。）注意：为了能够收集到洁净且具有活力的单细胞悬液，尽可能使用最低浓度的胰蛋白酶或HyQTase：在孔板中逐步滴加胰蛋白酶或HyQTase，浓度范围从0.05%到0.25%。注意：在37，室温和更低温度（例如，10）下逐步滴加胰蛋白酶或HyQTase以确定收集具有活力的单细胞悬液的最适温度。最低的温度可能是保持细胞活力的最适温度。5.确定所需细胞类型能够耐受清洗用的PBS。推荐组织培养DPBS。6.细胞从微载体上脱落后，用移液管温和地反复吹打微载体-细胞悬液，以使细胞形成单细胞悬液。（此处使用24-50 mL的移液管比较方便。对于更大的体积，可以选择使用
3、蠕动泵让微载体浆在无菌的管道中涡旋的方法。） 1.将培养容器从培养箱转移到生物安全柜中，将容器放置在转速设定为60 rpm的搅拌板上。2.使培养物处于搅拌状态，打开转瓶一个侧臂的盖子。按下取样按钮的同时，将Finnpipette移液器（或同等移液器）的长吸头深入到培养物的中部，但不要碰到转子，然后将取样按钮松开，让培养物样品快速吸入到移液器吸头中。将样品转移至15mL锥形管中。注意：微载体球珠占了从培养物中取出的样品体积的一部分。3.900rpm离心样品5-10分钟。要得到精确度和体积参考，将从样品中取出的培养基转移到量筒中，记录体积。（例如，从10 mL样品中取出9.5 mL培养基，则留下0
4、.5 mL微载体。）去除液体。4.在管中加入5 mL Thermo Scientific HyClone Dulbecco s磷酸盐缓冲液（DPBS）（SH30028）清洗微载体两次，去除上清之前震荡几次。两次清洗之间离心5-10分钟，形成微载体沉淀之后去除液体。注意：此步可在室温下操作，无需精确体积。5.要将细胞与微载体分离，向盛有清洗过的细胞-微载体的管中加入正确已知体积（见步骤3参考体积）的胰蛋白酶或HyQTase非哺乳动物细胞分离试剂（0.05%-0.25%），在所需温度下放置10分钟左右。用Finnpipette移液器，温和地将样品吸入吸头中再打出，反复吹吸几次以得到单细胞悬液。6.样品可以用来计数或者进行下一步操作。也可以进行细胞核计数。注意：据文献记录，微载体聚集物会使细胞计数产生偏差，导致样品难以准确测量。利用HyQSphere微载体的取样技术此方法适用于HyQSphere FACT 102L, CGEN 102L, Pro-F 102L, P Plus 102L和P 102L微载体。
