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1、1,贵阳医学院医学检验系黄海,实验 28 临床生化检验试剂盒性能评价实验,2,实验目的,掌握：试剂盒测定线性范围、试剂盒终点法和速率法测定时间反应曲线实验的原理。 熟悉：试剂盒稳定性试验的原理 。了解：影响试剂盒时间反应曲线的各项因素 。,3,一、线性范围试验,二、时间反应曲线实验,（一）终点法时间反应曲线实验,（二）连续监测法时间反应曲线实验,三、稳定性实验,4,实验原理,线性范围是指系统最终的输出值（浓度或活性）与被分析物的浓度或活性呈比例，并在允许的非线性误差以内的范围。 线性评价是测定被测物质浓度/活性的反应曲线接近直线的程度。 本试验配制不同浓度的葡萄糖标准溶液，用GOD-POD法试
2、剂测定相应其吸光度，以标准浓度为横坐标，测得的吸光度为纵坐标，在坐标纸上作图，即可绘制出一条直线，即剂量反应曲线（dose-response curve）。,一、线性范围试验,5,试剂与器材,1. 40mmol/L 葡萄糖标准溶液。2. 其他试剂 同GOD-POD法试剂。,6,操作步骤,将葡萄糖标准液和蒸馏水同时扩大10倍，制备9管梯度浓度的标准管（依次以40mmol/L标准液按0.6的比例进行等比稀释），测定时每个浓度作2次平行测定，且测定顺序应随机排列。,7,计算,以葡萄糖浓度值为横坐标，测定的吸光度值为纵坐标，在坐标纸上作图，若所有梯度浓度实验测试点在坐标纸上呈直线趋势，即可建立回归方程
3、y=a+bx。 要求a接近于0，b在0.971.03之间。若满足此条件，则可直接判断该测定方法是否在所要求的线性范围。 若a偏大，b1.03则认为在低浓度或高浓度处的实测值与预期值间存在较大偏差。 可舍去某一组数据，另作回归分析，直到a接近于0，b在0.971.03之间，此时变窄的线性范围即为真实的可报告范围。,8,注意事项,1. 应以葡萄糖浓度的预期值作为横坐标，测定值为纵坐标作图，而不能以葡萄糖浓度的预期值和对应的吸光度值作图。2. 有的测定特别是酶法测定，当酶量相对不足时，用标准液所作的线性范围可以达到指定的上限，但在测定同样高值样品时，结果却明显偏低，这通常是由样品中的介质效应所致。3
4、. 线性评价方法还可参照EP6文件进行。,9,评价,1. 根据浓度与对应测定值作直线回归分析，建立方程y=a+bx；使a尽量接近0，b在0.971.03时的测定范围为该方法的线性范围。 理想的情况是该方法的分析范围的上限应能使95%的临床标本不经稀释均能得到正确的测定结果。2. 试剂盒测定项目的线性范围要求能覆盖该项目常见医学决定水平。,10,3. 若线性范围变窄该方法应废弃。造成线性范围变窄的主要原因有：生产中组分投料不足；生产后组分稳定性差；运输和贮存不当等。必要时应寻找原因，以利改进。,评价,返回本实验目录,11,实验原理,二、时间反应曲线实验,终点法是测定化学反应达到平衡时的产物生成量
5、，这样才能较准确地反映待测物的量。用略高于参考值上限的标准液或定值血清进行测定，以观察反应达到平衡期的时间以及反应持续和终止的时间，即可分析有关试剂盒的性能指标,（一）终点法时间反应曲线实验,12,试剂与器材,1. 8.9 mmol/L葡萄糖标准溶液。2. GOD-POD法测血糖试剂盒,13,操作步骤,1. 取8.9 mmol/L葡萄糖标准溶液，按试剂盒说明书 规定的样品与试剂比例加样检测，每分钟记录吸 光度1次，连续监测10min，同时用蒸馏水代替样 品作试剂空白的相应曲线。以吸光度为纵坐标，反应时间为横坐标作图，观 察平衡期出现、持续和终止的时间点。,14,评价,1. 若试剂空白的吸光度大
6、于规定标准，表示试剂质量有了变化不能使用，否则会影响测定的精密度和准确度。2. 试剂空白的反应速度时间曲线应平坦，吸光度在整个反应期间无明显波动，否则，说明试剂本身不稳定，会导致测定偏差。,15,评价,3. 反应能否在规定的时间内到达平衡，达到平衡的时间应在临床生化自动分析仪终点法读取测定吸光度的时间之前。4. 反应达到平衡后，吸光度最大并维持不变，这一期间为反应稳定期。终点法测定应在这一期间读取吸光度，尤其是对显色不稳定的反应，应严格控制比色测定在稳定期内完成。,返回本实验目录,16,（二）连续监测法时间反应曲线实验,实验原理,连续监测法测定的是酶促反应的初速度。 本实验用HK法血糖试剂盒进
7、行测定，连续观察该反应中的延迟期、线性期和混合期的整个过程，即可分析连续监测法试剂盒的性能指标。,17,试剂与器材,1. 8.9 mmol/L葡萄糖标准溶液。2. GOD-POD法测血糖试剂盒。,18,操作步骤,1. 取8.9 mmol/L葡萄糖标准溶液，按试剂盒说明书规定的样品与试剂比例加样检测，每分钟记录吸光度1次，连续监测10min，同时用蒸馏水代替样品作试剂空白的相应曲线。2. 以吸光度为纵坐标，反应时间为横坐标作图，观察平衡期出现、持续和终止的时间点。,19,评价,1. 若试剂空白的吸光度大于规定标准，表示试剂质量有了变化不能使用，否则会影响测定的精密度和准确度。2. 试剂空白的反应
8、速度时间曲线应平坦，吸光度在整个反应期间无明显波动，否则，说明试剂本身不稳定，会导致测定偏差。,20,评价,3. 反应达到平衡后，吸光度最大并维持不变，这一期间为反应稳定期。终点法测定应在这一期间读取吸光度，尤其是对显色不稳定的反应，应严格控制比色测定在稳定期内完成。,返回本实验目录,21,三、稳定性实验,实验原理,试剂盒的稳定性是指试剂盒试剂的不同状态在不同条件贮存后所保持其测定准确性的性能。由于温度、环境等条件发生变化，试剂的稳定性也随贮存条件和放置时间会发生变化，其变化的主要倾向是随贮存时间的延长，试剂空白的吸光度不断增加和对高值标本测定结果降低。,22,试剂与器材,1. 20mmol/
9、L 葡萄糖标准溶液。2. GOD-POD法测定血糖试剂盒。,23,操作步骤,1.设试剂空白，标准（5.55mmol/L），标准（20mmol/L）三管，按GOD-POD法测定血糖方法操作，以蒸馏水调零分别测定各管的吸光度。2. 每天按上述方法作一次并作记录，连续观察10次。3. 以吸光度为纵坐标，天数为横坐标，绘制每天的吸光度变化图，并作出稳定性的评价。,24,注意事项,1. 试剂盒的稳定性与贮存条件密切相关，杜绝使用过程中工作液受污染也是保持稳定性的关键。2. 评价试剂盒的稳定性应采用高值标本进行，因高值标本与试剂发生反应需要消耗更多的试剂成份更易发现问题，以及其介质效应也不可忽视。,25,
10、评价,1. 判断指标一般按试剂盒说明书上规定的要求进行判断。 如无规定可计算出发生偏差时的结果与标准浓度比较，若出现的误差大于医学决定水平下的允许误差即不可取。 本葡萄糖测定的允许误差为0.56mmol/L。2. 稳定性实验的结果应在规定的保质期内。试剂空白、标准和标准三管测定结果呈平行直线。若出现升高或下降的趋势，都属不稳定。,返回本实验目录,26,思考题,1. 简述评价商品试剂盒测定线性范围的原理和方法。2. 剂量反应曲线怎样绘制？怎样做统计方法和性能评价？3. 导致线性范围变窄的原因有哪些？4. 简述试剂盒终点法测定时间反应曲线试验的原 理？5. 怎样绘制终点法测定时间反应曲线图？6. 怎样根据终点法测定时间反应曲线图来评价其性能？,27,7. 简述试剂盒连续监测法测定时间反应曲线试验的 原理。8. 怎样绘制连续监测法测定时间反应曲线图？9. 怎样根据连续监测法测定时间反应曲线来评价其 性能？10. 简述试剂盒稳定性试验的原理及其意义。11. 稳定性试验曲线图怎样绘制？,思考题,28,谢谢！,返回总目录,
