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1、1,北华大学医学检验学院赵云冬,实验 11 溴甲酚绿法测定血清清蛋白,2,实验目的,掌握：溴甲酚绿法测定血清清蛋白实验原理。熟悉：溴甲酚绿试剂配制。了解：显色时间及试剂pH对测定结果的影响。,3,一、溴甲酚绿法测定血清清蛋白,二、显色时间改变对溴甲酚绿法 测定血清清蛋白结果影响,三、pH改变对溴甲酚绿法测定血清 清蛋白结果影响,4,实验原理,一、溴甲酚绿法测定血清清蛋白,溴甲酚绿（BCG）在pH4.20的环境中，有非离子去垢剂（Brij-35）存在时，可与清蛋白（Alb）结合形成蓝绿色复合物，在波长630nm处有吸收峰，其颜色的深浅在一定范围内与清蛋白含量成正比，与同样处理的清蛋白标准液比较，
2、可求得血清中清蛋白含量。,5,试剂与器材,11mol/L NaOH溶液20.5mol/L琥珀酸缓冲贮存液 310mmol/L BCG贮存液 4叠氮钠贮存液 5聚氧化乙烯月桂醚（Brij-35）贮存液6BCG试剂 此溶液pH应为4.15 0.05。760g/L清蛋白标准液8仪器 自动生化分析仪或分光光度计。,6,操作步骤,1生化自动分析仪分析法 各参数见有关仪器操作说明书。2手工操作法 取试管3支，按表操作。,混匀，室温10min，在波长630nm处用空白管调零，读取标准管和测定管吸光度。,7,计算,参考范围,成人：清蛋白 （3555）g/L，A/G =1.21.5,8,临床意义,1血清清蛋白浓
3、度增高 严重脱水所致的血浆浓缩。2血清清蛋白浓度降低（1）蛋白质丢失 见于大出血和严重烧伤。（2）摄入不足或消耗增加 营养不良、肠道肿瘤、肝功能受损、肾病蛋白尿、结核病伴慢性出血和恶性肿瘤等。（3）合成障碍 肝脏疾病。（4）清蛋白分布异常 门静脉高压患者清蛋白从血管内漏入腹腔；肝硬化导致门静脉高压时，由于合成减少和大量漏入腹腔，使清蛋白显著降低。,9,临床意义,3无清蛋白血症 极少见的先天性清蛋白缺乏症，患者血清中几乎没有清蛋白。4A/G比值 某些病人可同时出现清蛋白减少和球蛋白升高的现象，严重者A/G比值1.0，这种情况称为A/G比值倒置。,10,注意事项,1BCG是一种pH指示剂，变色域为
4、pH3.8（黄色）5.4（蓝色），必须严格控制反应液的pH，pH升高可使染料空白升高，与清蛋白结合率下降。,11,注意事项,2BCG与蛋白结合的特异性较低，不但与清蛋白呈色，而且还可与其他蛋白质呈色，其中1-球蛋白、TRF、Hp最明显，但反应速度不同，清蛋白可立即反应（快反应），其他蛋白质反应慢（慢反应）。由于血清与BCG试剂一经混合“慢反应”即可发生，约持续1h完成，故有试剂要求在1min内测定吸光度，排除“慢反应”干扰。,12,注意事项,3BCG试剂也可用其他缓冲液如枸橼酸盐或乳酸盐缓冲液。琥珀酸盐缓冲液的校正曲线通过原点，线性好，灵敏度高，为首选推荐配方。4叠氮钠有防腐作用。Brij-3
5、5可提高蛋白质与染料的结合力及溶解度，提高呈色稳定性，可用其他表面活性剂代替（如吐温-20或吐温-80，终浓度为2ml/L），灵敏度和线性范围不变。,13,注意事项,5严重高脂血症，需做标本空白管（血清0.02ml，琥珀酸缓冲贮存液4.0ml），用琥珀酸缓冲贮存液调零，测定标本空白管吸光度，用测定管吸光度减去标本空白管吸光度，计算结果。,14,评价,1血清清蛋白测定法主要有色氨酸含量法、染料结合法、电泳法、免疫化学法和电化学测定法。2. BCG法操作简便、快速，既可手工操作，也能自动化分析，是目前国内测定清蛋白最常用的方法。3Vc0.4g/L、血红蛋白4g/L对测定无影响。4本法线性范围为10
6、 g/L60g/L。,返回实验目录,15,二、显色时间改变对溴甲酚绿法测定 血清清蛋白结果影响,BCG与清蛋白结合的特异性较低，不但与清蛋白呈色，而且还可与其他蛋白质呈色，其中1-球蛋白，TRF、Hp最明显。但BCG与不同蛋白质反应速度不同，清蛋白可立即反应（快反应），其他蛋白质反应慢（慢反应）。,实验原理,16,试剂与器材,同溴甲酚绿法测定血清清蛋白,17,操作步骤,1. 按表3-2操作。2. 各管混匀，室温放置，显色时间分别为：30s、1min、5min、10min、15min及20min，每一个显色时间作9个测定管，在波长630nm处用空白管调零，读取标准管和测定管吸光度。,18,计算,
7、1. 计算各组 、S。表3-3 不同显色时间清蛋白测定结果（g/L）,19,计算,2. 对6组不同显色时间测定的结果进行方差分析，计算F值（F值计算参见医学统计学教材），查F界值表（P=0.05），比较F、F表。,20,结果判断,若FF表，则说明不同显色时间对溴甲酚绿法测定清蛋白结果有显著性差异。,返回实验目录,21,实验原理,三、pH改变对溴甲酚绿法测定血清 清蛋白结果影响,BCG是一种pH指示剂，变色域为pH3.8(黄色)5.4(蓝色)， 试剂pH改变可使染料与清蛋白结合率改变。,22,试剂与器材,10.5mol/L琥珀酸缓冲贮存液（pH3.6）20.5mol/L琥珀酸缓冲贮存液、3BCG
8、试剂4. 其它 同溴甲酚绿法测定血清清蛋白,23,操作步骤,1. 分别取用pH3.6，pH3.8，pH4.0，pH4.2，pH4.4 BCG试剂。每组作9个测定管。按表3-2操作。2. 各管混匀，室温放置10min，在波长630nm处用空白管调零，读取标准管和测定管吸光度。,24,计算,1. 计算各组 、S。,表3-3 不同显色时间清蛋白测定结果（g/L）,25,计算,2. 对5组不同pH测定的结果进行方差分析，计算F值（F值计算参见医学统计学教材），查F界值表（P=0.05），比较F、F表。,26,结果判断,若FF表，则说明不同pH对溴甲酚绿法测定清蛋白结果有显著性差异。,27,1简述BCG法测定血清清蛋白原理。2BCG试剂中Brij-35有什么作用？可以用其他表面活性剂代替吗？3样品与BCG试剂显色时间延长对Alb测定结果有何影响？4BCG试剂pH对Alb测定是否有影响？测定结果如何变化？,思考题,返回总目录,28,返回总目录,谢谢！,
