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1、 利用不同的方法筛选与鉴定转化子 院系: 生命科学学院 专业:生物工程 班级:10生物工程一班 姓名: 周伟竞 学号:1014200006 摘要 本文通过蓝白斑筛选、菌落直接PCR、提质粒进行PCR、酶切鉴定的实验 方法,通过-互补筛选(蓝白斑)从转化子中筛选重组子,由于 pET32-CaM5 Vector 上带有 lacZ 基因,因此可以通过菌落直接PCR的分子鉴定,可以鉴定细 菌中有没有转入外源DNA;然后再挑取单菌落进行培养、提取质粒,通过凝胶 电泳观察质粒的大小;最后用限制性内切酶切割大小符合的质粒,电泳观察酶 切片段的大小是否与预期的一致。 关键词 菌落直接PCR 提质粒 酶切 鉴定
2、 前言通过本次的一系列实验操作,目的是为了能够筛选出含有 pET32-CaM5 质 粒的大肠杆菌 DH5,并进行鉴定该转化子。质粒具有稳定可靠和操作简便的 优点,若要克隆较小的 DNA 片段(10kb)且结构简单,则质粒是最好使用的 了。因为在实际操作过程中,用重组质粒转化的大肠杆菌 DH5 的量少,连接 产物没有也不可能在经过分离纯化而获得纯的重组质粒,连接产物中混有载体 自连而成的空载体、载体与目的片段连接而成的目的重组质粒和载体与非目的 片段连接而成的非目的重组质粒。同时,宿主的转化效率极低,因此,绝大部 分宿主是没有被转化的,所以很有必要对转化产物进行筛选与鉴定。 二、摘要: 利用含有
3、抗性的培养基从转化后代中筛选出转化子。因为不含有 pET32- CaM5 质粒的大肠杆菌 DH5 是不能再含有抗生素的培养基上生长的,而含有 重组质粒的细菌则能够在该培养基上生长,采用 A mp 抗性筛选,所以就可以 筛选出相应的转化子。然后在进行相应的鉴定试验。对少量的转化大肠杆菌菌 体进行 PCR 反应,进行鉴定,再从相应的重组子中提取质粒,进行酶切实验, 观察电泳酶切片段的大小是否与预期的一致。从而达到实验的真正的目的。三、实验目的: 1. 学习 DNA 重组技术的关键技术步骤。 2. 把体外的重组的 DNA 引入宿主细胞中,是具有新的遗传性状,并从中 筛选出转化子。 3. 学习电泳法筛
4、选、鉴定重组质粒的方法,通过筛选分析、鉴定出具有所 需重组 DNA 分子的宿主细胞。 四:实验原理: 1. 通过抗生素抗性从转化后代中筛选出转化子。因为非转化菌没有质粒而 缺乏相应的抗生素抗性,所以可将转化产物涂布在含有相应抗生素的培 养基上筛选.只有含有相应抗性的抗生素抗性基因才能生长繁殖形成菌落. 2. 通过菌落直接 PCR 从转化子中筛选出转基因生物,扩增出特殊目的基因 片段,判断所得转化子是否为重组子.但因为 PCR 技术的高灵敏性,往往会 产生假阳性结果.所以有必要进一步进行鉴定. 3. 从候选重组子中提取质粒,通过凝胶电泳观察质粒的大小,再利用限制性 内切酶切割大小符合的质粒.电泳
5、观察酶切片段的大小是否与预期的一致. 五:实验材料、试剂: 1. 筛选出来的转化子(含 pET32-CaM5 质粒的大肠杆菌 DH5) 2 PCR 仪,恒温摇床,台式高速离心机,恒温水浴锅,琼脂糖凝胶电泳装置,电 热恒温培养箱,电泳仪,超净台,微量移液枪,1.5mL 离心管。 3 试剂: 质粒提取试剂:溶液 I:50 mM 葡萄糖,10 mM EDTA,25 mM Tris-HCl(pH8.0) ,用前加溶菌酶 4 mg/L;溶液 II:NaOH 溶液(内含 1% SDS):0.2 M;溶液 III(pH4.8): 60 mL 5 mol/L 醋酸钾,11.5 mL 冰醋酸,28.5 mL H
6、2O;饱和酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)氯仿TE 缓冲液(pH8.0): 10 mM Tris-HCl,1 mM EDTA,其中含 RNA 酶(RNaseA): 20 g/ml醋酸铵(pH7.58.0): 7.5 mol/L异丙醇;70%乙醇;无水乙醇。酶切试剂:限制性核酸内切酶:Hind(AAGCTT)限制性核酸内切酶缓冲液:10M Buffer0.5TBE Buffer1%琼脂糖PCR 反应试剂: 1.10x PCR buffer 、rTaq 酶 2. dNTP mixtures:dATP, dTTP, dGTP, dCTP 各 2.5mM 3. 前向引物(10uM):5-CGCGAA
7、TTCATGGCAGATCAGCTCACCGATGATC-3 4. 反向引物(10uM):5-AGAGCGGCCGCCTTTGCCATCATAACTTTGACAAA-3 5. 1.0% 琼脂糖凝胶 六、实验步骤: 1 转化子的筛选 取连接反应转化原液100uL,涂布与筛选培养基上,直至液体被完全吸收。 倒置平板于37继续培养 16 个小时,平板所长出的单菌落(为白色的) 即为转化子。 2 菌落直接PCR: 用无菌牙签分别挑取 3 个白色单菌落,在编好号码的 PCR 反应管中的底部分别涂抹,然后在 PCR 管仲配制 50L 反应体系. PCR 反应混合液的配制 (50l)10 x PCR buf
8、fer 2ldNTP mixture 1.6l前向引物 (P1) 0.8l反向引物 (P2) 0.8lDNA 模板 l(用牙签挑取菌落在 PCR 管中 涂抹rTaq 酶 0.2l灭菌蒸馏水 14.6l 所有试剂加完后,轻轻混匀,稍离心后即可,为了防止反应混合液蒸发, 可添加 20l 矿物油覆盖。 PCR 仪的参数设置94 2 min94 30sec35 cycles 62 30sec 72 30sec72 5 min 琼脂糖凝胶电泳检测 反应结束后,取 5l PCR 产品,加入 1l 6 或 10 x loading buffer,混匀后点 样,电泳 15min。 重组质粒的大小鉴定: 用无菌
9、牙签从平板上挑选PCR 反应阳性菌落,与没有检测出特异性条带的 假阳性菌落,接种于含Amp 50g/mL 的5mL LB 液体培养基中,37下震荡培养 12 个小时。 质粒的提取: 1.吸取1.4mL 菌液至1.5mL 离心管中.2.离心(8000rpm,1min),弃去上清液.3.加入150L 溶液,用旋涡振荡器充分悬浮菌体. 4.加入200L 溶液,加盖后温和颠倒 56 次,直至透明状.(此步骤在5 分 钟内完成)5.加入150L 遇冷的溶液,加盖后反复颠倒混匀,直至出现白色絮状沉淀, 冰浴5 分钟. 6.离心(14000rpm,10min,4),移取上清液于另一干净离心管中.7.向上清液
10、中加等体积的苯酚/氯仿/异丙醇(25:24:1),振荡后均匀抽提,离 心(14000rpm,5min),溶液将出现分层.8.移取上层水相溶液(约450L)于另一干净离心管,加等体积氯仿,振荡混匀 抽提,离心(14000rpm,5min) 9.移取上层水相溶液于另一干净离心管,加入1/10 体积的醋酸钠(pH5.2)和 2 倍体积无水乙醇混匀,冰浴30min. 10.离心(14000rpm,10min,4),倒掉上清液.11.加0.5mL 预冷的70%酒精振荡,洗DNA 沉淀一次,离心5 分钟,倒掉上层清 液.12.真空抽干或自然风干沉淀.13.加20L30L TE 缓冲液使DNA 完全溶解,降
11、解RNA 杂质,室温放置10min. 用作琼脂糖电泳. 14.各取5L 质粒DNA 加入1L 6loading buffer 混匀,进行点样. 15.进行电泳,电泳条件:120V,25min. 16. 利用核酸蛋白检测仪进行DNA 浓度和纯度检测。 重组质粒的酶切鉴定: DNA 浓度纯度的测定空白测定:吸取 200 l 蒸馏水至比色杯,进行紫外光空白测定。DNA 测定:取质粒 DNA 1 l 至一干净的离心管,加入 199 l 蒸馏水稀释 混匀,所有溶液加入到干净的比色杯中,测定 260 nm 及 280 nm 的光吸收值; 计录 DNA 浓度及 OD260/OD280 比值。酶切反应酶切反应
12、液的配制:Hind 1l10M buffer 2lDNA 5l ddH2O 12l 酶切反应条件:37水浴 23 小时。反应结束后,向反应液中加入2.2l 10loading buffer,混匀以停止酶 切反应,所有22.2l 样品均点在同一个点样孔中。电泳条件:120V,45 分钟左 右。 七、实验注意事项: 1、PCR 反应时:所用的与P有关的试剂,只作实验使用,而不 能挪作他用。操作中所使用的管,离心管、吸管头等只能一次性 使用。特别注意防止引物受到同一引物扩增的的污染。 2、质粒的提取时:裂解液要预热,以抑制,加速蛋白质变性, 促进溶解。酚一定要碱平衡。取个上清液时,不应贪多,以防止
13、非核酸类成分干扰。异丙醇、乙醇、等要预冷,以减 少的降解,促进与蛋白质等的分相及沉淀。 3、酶切时:酶切的应具备一定的纯度,其中不能含有迹量的酚、氯 仿、等。内切酶从冰箱中取出后,应放入冰浴中,其他 实际加完后最后加。 八、实验结果:1:PCR 电泳结果2、质粒的提取:3、酶切电泳图:八、实验结果分析:从本次的实验结果图来看,的电泳带还是比较清晰的,即从转化子从 扩增出相应的目的基因片段,表明利用抗性培养基筛选出一定的转化子了。 但是质量的提取与鉴定的实验图来看,电泳带不是很清晰(即比较暗) ,可能 是的降解不完全、含有较多的蛋白质杂质等,所以造成所提出来的 不是很纯。 从酶切的电泳图来,没有完全得到 pET32-CaM5 的 6131bp 和 219bp 两个片 段,应该是 Hind酶没有酶切完全,所以造成此次的实验结果不是很理想。 九、实验讨论: 通过本次的转化子的筛选与鉴定实验,总的来说还是筛选到了含有转化子 的大肠杆菌,并进行了相关的鉴定实验,得到了一定的实验预期结果。还 有经过一个学期的基因工程实验操作和老师的悉心指导下,使我对基因工