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1、分生不全断裂基因真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因（splite gene ） 。开放阅读框架开放阅读框open reading frame，ORF 是结构基因的正常核苷酸序列，从起始密码子到终止密码子的阅读框可编码完整的多肽链，其间不存在使翻译中断的终止密码子。ORF 识别包括检测这六个阅读框架并决定哪一个包含以启动子和终止子为界限的 DNA 序列而其内部不包含启动子或终止子，符合这些条件的序列有可能对应一个真正的单一的基因产物。ORF 的识别是证明一个新的 DNA 序列为特定
2、的蛋白质编码基因的部分或全部的先决条件。荧光定量 PCR荧光定量 PCR( realtime fluores-cence quantitative PCR，RTFQ PCR) 是 1996 年由美国 Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对 PCR 产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度.PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收
3、；刚开始时, 探针结合在 DNA 任意一条单链上;PCR 扩增时，Taq 酶的 5端 3端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步。反向 PCRPCR 只能扩增两端序列已知的基因片段，反向 PCR 可扩增中间一段已知序列，而两端序列未知的基因片段不扩增。反向 PCR 的目的在于扩增一段已知序列旁侧的 DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成 DNA。反向 PCR 可用于研究与已知 DNA 区段相连接的未知染色体序列，因此又
4、可称为染色体缓移或染色体步移。这时选择的引物虽然与核心 DNA 区两末端序列互补，但两引物 3端是相互反向的。扩增前先用限制性内切酶酶切样品 DNA，然后用 DNA 连接酶连接成一个环状 DNA 分子，通过反向 PCR 扩增引物的上游片段和下游片段；现已制备了酵母人工染色体（YAC）大的线状 DNA 片段的杂交探针，这对于转座子插入序列的确定和基因库染色体上 DNA 片段序列的识别十分重要。探针探针是一小段单链 DNA 或者 RNA 片段（大约是 20 到 500bp） ，用于检测与其互补的核酸序列。双链 DNA 加热变性成为单链，随后用放射性同位素（通常用磷-32） 、荧光染料或者酶（如辣根
5、过氧化物酶）标记成为探针。磷-32通常被掺入组成 DNA 的四种核苷酸之一的磷酸基团中，而荧光染料和酶与核酸序列以共价键相连。当将探针与样品杂交时，探针和与其互补的核酸（DNA 或 RNA）序列通过氢键紧密相连，随后，未被杂交的多余探针被洗去。最后，根据探针的种类，可进行放射自显影、荧光显微镜、酶联放大等方法来判断样品中是否，或者何位置含有被测序列（即与探针互补的序列） 。基因组基因组，Genome，一般的定义是单倍体细胞中的全套染色体为一个基因组，或是单倍体细胞中的全部基因为一个基因组。可是基因组测序的结果发现基因编码序列只占整个基因组序列的很小一部分。因此，基因组应该指单倍体细胞中包括编码
6、序列和非编码序列在内的全部 DNA 分子。说的更确切些，核基因组是单倍体细胞核内的全部 DNA 分子；线粒体基因组则是一个线粒体所包含的全部 DNA 分子；叶绿体基因组则是一个叶绿体所包含的全部DNA 分子。酵母双杂交酵母双杂交系统由 Fields 和 Song 等首先在研究真核基因转录调控中建立 。典型的真核生长转录因子， 如GAL4、 GCN4、等都含有二个不同的结构域： DNA 结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别 DNA 上的特异序列， 并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游
7、， 转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用， 启动它所调节的基因的转录。基序（motif ）英文 motif 的缩写，也翻译为“模序” ， “模体” ，DNA，蛋白质等生物大分子中的保守序列，在反式作用因子的结构中，基序一般指构成任何一种特征序列的基本结构（既指此具功能的基本结构，也指编码此结构的蛋白质/DNA序列） ，作为结构域中的亚单元，其功能是体现结构域的多种生物学作用。移框突变移码突变、框移突变，在正常的 DNA 分子中，碱基缺失或增加非 3 地倍数，造成这位置之后的一系列编码发生移位错误的改变，这种现象称移码突变。DNA 损伤可以分为四种类型：错配、缺失、插入和重排。缺失或插入都
8、可导致框移突变，框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变，其后果是翻译出的蛋白质可能完全不同。3 个或 3n 个核苷酸的插入或缺失，不一定引起框移突变。启动子RNA 聚合酶特异性识别和结合的 DNA 序列。 启动子是基因（gene）的一个组成部分，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度。启动子（Promoters）就像“开关” ，决定基因的活动。既然基因是成序列的核苷酸（nucleotides） ，那么启动子也应由核苷酸组成。启动子本身并不控制基因活动，而是通过与称为转录因子（transcription factor）的这种蛋白质（proteins）结合而控制
9、基因活动的。转录因子就像一面“旗子” ，指挥着酶（enzymes）(RNA 聚合酶 RNA polymerases) 的活动。这种酶指导着 RNA 复制。癌基因癌基因是英文 oncogene 的译名，onco 源于希腊字 onkos，意思是肿瘤。癌基因是指人类或其他动物细胞（以及致癌病毒）固有的一类基因。又称转化基因，它们一旦活化便能促使人或动物的正常细胞发生癌变。顾名思义，癌基因是一类会引起细胞癌变的基因。其实，原癌基因有其正常的生物学功能，主要是刺激细胞正常的生长，以满足细胞更新的要求。只是当原癌基因发生突变后，才会在没有接收到生长信号的情况下仍然不断地促使细胞生长或使细胞免于死亡，最后导
10、致细胞癌变。信号肽常指新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移（定位）的 N-末端的氨基酸序列（有时不一定在 N 端） 。信号肽位于分泌蛋白的 N 端。一般由 1530 个氨基酸组成。包括三个区：一个带正电的 N 末端，称为碱性氨基末端：一个中间疏水序列以中性氨基酸为主，能够形成一段 d 螺旋结构，它是信号肽的主要功能区；一个较长的带负电荷的 C 末端，含小分子氨基酸，是信号序列切割位点也称加工区。当信号肽序列合成后，被信号识别颗粒(SRP)所识别，蛋白质合成暂停或减缓，信号识别颗粒将核糖体携带至内质网上，蛋白质合成重新开始。看家基因（housekeepinggene）看家基因(house-ke
11、eping gene) 又称管家基因又称持家基因，维持细胞最低限度功能所不可少的基因, 如编码组蛋白基因、编码核糖体蛋白基因、线粒体蛋白基因、糖酵解酶的基因等。这类基因在所有类型的细胞中都进行表达，因为这些基因的产物对于维持细胞的基本结构和代谢功能是必不可少的。转染（transfection）转染(transfection)指真核细胞由于外源 DNA 掺入而获得新的遗传标志的过程。常规转染技术可分为瞬时转染和稳定转染（永久转染）两大类。前者外源 DNA/RNA 不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。后者也
12、称稳定转染，外源DNA 既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome ）存在。尽管线性 DNA 比超螺旋 DNA 转入量低但整合率高。外源 DNA 整合到染色体中概率很小，大约 1/104 转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因） ，潮霉素 B 磷酸转移酶（HPH） ，胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。microRNAMicroRNA (miRNA) 是一类由内源基因编码的长度约为 22 个核苷酸的非编码单链 RNA 分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控。大多数 miRNA 基因以单拷贝、多拷贝或基因簇(
13、cluster) 的形式存在于基因组中。每个miRNA 可以有多个靶基因，而几个 miRNA 也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个 miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个 miRNA 的组合来精细调控某个基因的表达。选择性剪接选择性剪接（也叫可变剪接）是指从一个 mRNA 前体中通过不同的剪接方式（选择不同的剪接位点组合）产生不同的 mRNA 剪接异构体的过程，而最终的蛋白产物会表现出不同或者是相互拮抗的功能和结构特性，或者，在相同的细胞中由于表达水平的不同而导致不同的表型。真核基因中内含子的存在是可变剪接的分子基础。若可变剪接产生的 mRNA 差异仅在 5和 3非翻
14、译区，因此产生的蛋白相同，差异区对翻译起调控作用。比较真核与原核细胞的启动子结构和功能及翻译起始的异同点启动子：结构：保护区内有一个由 5 个核苷酸组成的共同序列，是 RNA 聚合酶的紧密结合点，称为 Pribnow 区（Pribnow box） ，这个区的中央大约位于起点上游 10bp 处，所以又称为 -10 区。许多原核生物都含有这两个重要的启动子区：RNA 聚合酶同启动子结合的区域称为启动子区。在真核生物基因中，Hogness 等先在珠蛋白基因中发现了类似 Pribrow 区的 Hogness 区（Hogness box） ，这是位于转录起始点上游-25-30 bp 处的共同序列似 TA
15、AA，也称为 TATA 区。另外，在起始位点上游-70 -78 bp 处还育另一段共同序列 CCAAT，这是与原核生物中-35bp 区相对应的序列称为 CAAT 区（CAAT box） 。转录：RNA 聚合酶原核生物 RNA 聚合酶种多聚体蛋白质（2） ；真核生物 RNA 聚合酶有三种（RNA 聚合酶、）分别转录同种类 RNA2.转录过程原核生物转录过程转录全过程均需 RNA 聚合酶催化，起始过程需核心酶由 亚基辨认起始点被辨认 DNA 区段-35 区区段酶与模板结合松弛酶移向-10 区并跨入转录起始点真核生物转录过程，转录起始前-25bp 区段多有典型 TATA 序列称 TATA box 通
16、常认启动子核心序列此外 DNA分子上还具有其影响转录顺式作用元件及能直接、间接辨认和结合转录上游区段蛋白质反式作用因子其直接或间接结合 RNA 聚合酶转录因子真核生物 RNA 聚合酶与 DNA 分子直接结合而需依靠众多转录因子翻译：原核生物与真核生物核蛋白体组成同 2 真核生物肽链合成起始过程与原核生物相似更复杂真核生物有同翻译起始成分起始因子种类更多起始甲硫氨酸需甲基化等成熟真核 mRNA 有 5帽子和 3polyA 尾结构 3.真核生物肽链合成延长过程与原核生物基本相似只有同反应体系和延长因子 4.真核生物翻译终止过程与原核生物相似三.表达调控原核基因表达调控与真核存多共同之处因原核生物没有细胞核亚细胞结构及其基因组结构要比真核简单得多。简述重组 DNA 技术的原理和主要过程，结合本专业举出一个应用该技术的例子并说明意义干细胞定义及当前研究热点干细胞（stem cells，SC ）是一类具有自我复制能力（ self-renewing）的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞
