《胡萝卜素和叶黄素的提取方法》由会员分享，可在线阅读，更多相关《胡萝卜素和叶黄素的提取方法（3页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、分光光度法A 装置 A.a 色谱柱 内径 12.5mm，长 30cm 的硬质玻璃管，下端内径 2mm，长约 10cm 的毛细管伸到 25ml 容量瓶的颈部。 A.b 真空过滤装置 用于收集洗脱液于容量瓶内。该装置经橡皮塞与色谱柱相连。 B 试剂 B.a 丙酮 无水，不含醇。在约 10 目锌粒存在下蒸馏得到。 B.b 已烷 市售品。 B.c 提取剂 已烷-丙酮- 无水乙醇- 甲苯(10+7+6+7)。 B.d 吸附剂 硅胶 G 和硅藻土按 1+1(w/w)于机械混料机中混合 12h。 B.e 吸附剂 活性氧化镁和硅藻土按 1+1(w/w)于机械混料机中混合 12h。 B.f 氢氧化钾甲醇溶液 4
2、0%溶解 40g 氢氧化钾于甲醇中，冷却后用甲醇稀释至 100ml。 B.g 硫酸钠溶液 10%。溶解 10g 无水硫酸钠于 100ml 水中。 B.h 洗脱液 B.h.1 胡萝卜素-已烷-丙酮(96+4) 溶液。 B.h.2 一羟基色素MHP- 已烷丙酮(90+10) 溶液。 B.h.3 二羟基色素DHP-已烷-丙酮 80+20)溶液。 B.h.4 总叶黄色TX-已烷- 丙酮 -甲醇(80+10+10)溶液。 B.i 1-苯偶氮基-2-萘酚(C.I. 溶剂黄 14；苏丹 I)标准溶液 B.i.1 贮备液 1.0mM。用热无水乙醇重结晶标准品，并在 70真空干燥箱中干燥至恒重。溶解 0.124
3、1g 结晶于 500ml 丙酮-异丙醇(1+1)中。 B.i.2 工作液 0.04mM。用丙酮-异丙醇(1+1)稀释 20ml 贮备液至 500ml，在暗处保存。 C 样品制备 将样品磨碎，过 40 目筛。准确称取适量样品2g 玉米麸质或苜蓿粉；50mg 金盏花粉；4g 混合饲料于 100ml 容量瓶中，用移液管加入 30ml 提取液，密塞，旋转振摇 1min。对于湿度较低的样品，如金盏花，脱水苜蓿或玉米麸质未经空气干燥，以 1ml 水/2g 样品的比例加水到烧瓶中，密塞，旋转振摇 1min。对于高湿度经空气干燥样品，可省去加水。 C.a 热皂化 用于快速提取和含叶黄素酯的样品。用移液管加 2
4、ml4g 混合饲料加 4ml40%的氢氧化钾甲醇液至烧瓶中，旋转振摇 1min，然后将烧瓶置于 56水浴上加热 20min，接上空气冷凝管或冷却烧瓶颈部，以防止溶剂损失。冷却样品，于暗处放置 1h。吸取 30ml 已烷至烧瓶中，旋转振摇 1min，用 10%Na2SO4 溶液稀释至刻度，剧烈振摇 1min。色谱分离前于暗处放置1h。上层液体积为 50ml。 C.b 冷却过夜 皂化 用于快速提取和含叶黄素酯的样品。用移液管加 2ml4g 混合饲料加 4ml40%的氢氧化钾甲醇液至烧瓶中，旋转振摇 1min，然后将烧瓶置于 56水浴上加热 20min，接上空气冷凝管或冷却烧瓶颈部，以防止溶剂损失。
5、冷却样品，于暗处放置 1h。吸取 30ml 已烷至烧瓶中，旋转振摇 1min，用 10%Na2SO4 溶液稀释至刻度，剧烈振摇 1min。色谱分离前于暗处放置1h。上层液体积为 50ml。 D 色谱法 将色谱柱置于过滤器上，并于其底部塞入少许脱脂棉或玻璃棉。装入约 12cm 高的吸附剂，抽真空，补加吸附剂，使高达 7cm，用平头器具如倒置的玻棒上的软木塞轻压吸附剂并平整表面，然后在吸附剂上面装入 2cm 高的无水 Na2SO4，并将其压紧。 D.a 总胡萝卜素 D.b 叶黄素分离 D.b.1 将 25ml 容量瓶置于过滤装置中，给色谱柱施以真空，使洗脱液液面接近吸附剂表面，然后立即加入 MHP
6、 洗脱液，一羟基色素玉米黄质，隐黄质和留在色谱柱内的任何单酯或双酯的谱带应比其它谱带先移至柱下方。当 MHP 的谱带全部洗脱，取下容量瓶置于暗处，达到室温后，用 MHP 洗脱液稀释至刻度，并测定其吸光度 A。 D.b.2 将 25ml 容量瓶置于过滤装置中，给色谱柱施以真空，使洗脱液液面接近吸附剂表面，然后立即加入 MHP 洗脱液，一羟基色素玉米黄质，隐黄质和留在色谱柱内的任何单酯或双酯的谱带应比其它谱带先移至柱下方。当 MHP 的谱带全部洗脱，取下容量瓶置于暗处，达到室温后，用 MHP 洗脱液稀释至刻度，并测定其吸光度 A。 D.c 总叶黄素 如要测定总叶黄素量，则从原提取液的上液层吸取一定
7、量新鲜溶液，加到装有 7cm 高吸附剂的色谱柱中，以已烷-丙酮(90+10)洗脱胡萝卜素，以已烷-丙酮- 甲醇(80+10+10)洗脱总叶黄素。E 测定 迅速测定溶液的吸光度 A，以使异构化和自氧化带来的损失减少到最小。首先，以标准工作溶液有 469479nm 间每间隔 1nm 检查校准分光光度计。若最大值不在 474nm，应重校准仪器。当仪器显示吸光度 A 的最大值是在 474nm，而狭缝的宽度为 0.03，则工作溶液的读数应是0.561474和 0.460(436)。仪器的偏离因子可通过下面的方程式进行校正。假如仪器无可控的狭缝，则假定(1)(2)染料标准工作溶液的吸光度 A 与胡萝卜素
8、2.35mg/L 在 436nm 及叶黄素2.38mg/L 在 474nm 下的吸光度 A 相同。以便估算浓度。$ 于 436nm 下测定胡萝卜素组分的吸光度 A，474nm 下测定 MHP 和 DHP 组分的吸光度 A。应控制洗脱液体积，使所测得的吸光度A 在 0.25 和 0.75 之间，以提高测定的准确度。 F 计算 下列方程式适用于校准过的分光光度计在窄狭缝宽度下测得的吸光度 A，196 和 236 分别为规定波长下全反 -胡萝卜素和全反叶黄素的 值；b 为比色池长度 (cm)，d 为稀释系数样品克数加于色谱柱的提取液毫升数/50ml 上液层最终稀释体积毫升数；f 为仪器偏离因子0.460/A436或 0.561/A474。A436 和 A474均为观察值。$胡萝卜素组分浓度(mg/lb) A436454f/(196bd)$MHP 组分浓度(mg/lb)，或 DHP 组分浓度(mg/lb)或总叶黄素浓度(mg/lb)A474454f/236bd
