生技整理考试重点

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1、说明：1、资料中未按名词解释、简答等的次序排版，如有需要，大家自行解决。2、有些细节，大家自己去看课件补充吧3、愿大家顺利。一、基因工程本章总体思路1、生物技术：包括基因工程、细胞工程 、发酵工程 、酶工程 、蛋白质工程 2、基因工程：在体外对 DNA 进行切割、拼接, 使遗传物质重新组合, 经载体转移到细胞中扩增表达, 获得人类所需产品, 或组建新生物类型的技术。3、基因工程诞生的理论基础：DNA 是遗传物质；DNA 双螺旋结构；中心法则和遗传密码4、基因工程诞生的技术突破：DNA 分子的体外切割与连接技术DNA 分子的核酸序列分析技术5、基因工程元年：1973 年6、基因工程的特征：1.

2、跨物种性：外源基因到另一种不同的生物细胞内进行繁殖2、无性扩增：外源 DNA 在寄主细胞内可大量扩增和高水平表达。1.1 工具酶7、工具酶：（以下为常用工具酶）工 具 酶 功 能限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割 DNADNA 连接酶 催化 DNA 中相邻的 5磷酸基和 3羟基末端之间形成磷酸二酯键，使 DNA 切口封合或使两个 DNA 分子或片段连接DNA 聚合酶 合成双链 cDNA 分子或片段连接 缺口平移制作高比活探针 DNA 序列分析 填补 3末端反转录酶 合成 cDNA 替代 DNA 聚合酶 I 进行填补，标记或 DNA 序列分析（含义：以 RNA 为模板合成 DNA 的 DNA

3、聚合酶）多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸 5羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶 在 3羟基末端进行同质多聚物加尾（1、探针标记 2、在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接）碱性磷酸酶 切除末端磷酸基（制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身连接）8、限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)：是一类能识别双链 DNA 中特殊核苷酸序列, 并在合适的反应条件下使每条链一定位点上的磷酸二酯键断开，产生具有 3-OH 基团和 5-磷酸基团的 DNA 片段的内切脱氧核糖核酸酶。分类: 包括限制性核酸内切酶 、（基因工程技术中常用型）作用：与甲基化酶共

4、同构成细菌的限制修饰系统，限制外源 DNA， 保护自身 DNA。9、平末端 (blunt end): DNA 的两条链在同一位置被切开，产生末端长度相等的 DNA 片段，即平末端。粘末端(sticky end)： DNA 分子的两条链在不同的位置（中间隔 2-4 核苷酸）被切开，形成一条交错的伤口，所得的 DNA 片段在末端都具有短的悬垂部分，即粘末端。10、同裂酶：来源不同的限制性内切酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同裂酶。同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割 DNA 后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。

5、11、DNA 连接酶的连接方式：1、粘性末端连接 2、平端连接 3. 末端修饰后进行连接4. 人工接头连接1.2 载体(vector)12、载体：是指能在连接酶作用下和外源 DNA 片段连接，实现外源 DNA 的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的 DNA 分子13、理想载体的基本条件：1、可转移性2、具有安全性3、合适的复制位点4、多克隆位点：广泛、特异5、选择标志，便于筛选和鉴定6、分子较小，可容纳较大的外源 DNA14、质粒 ： 存在于细菌染色体外的小型共价闭合环状 DNA 分子。要求：含有复制起点；含有多克隆位点（MCS） ；含有筛选标记； 高拷贝数；分子量小；易于导入宿主细胞15、T

6、-克隆载体：5端带一个不配对的碱基 T，这样的线性质粒可将 PCR 产物以 TA 配对连接的方式直接进行克隆，即 TA 克隆。用于 TA 克隆的载体被称为 T-克隆载体U-克隆载体 ：5 端带一个不配对的碱基 U 的线性质粒称为 U-克隆载体16、 噬菌体克隆载体优点： 其分子遗传学背景十分清楚； 载体容量较大，能容纳大约 23kb 的外源 DNA 片段； 具有较高的感染效率，其感染宿主细胞的效率几乎可达 100% 。 噬菌体分类;(1) 插入型载体 （insert vector）：其限制酶位点可用于外源 DNA 的插入(2) 取代型载体（replacement vector）：具有成对限制酶

7、位点，外源 DNA可取代两个限制位点上的 DNA 区段。重组 DNA 与包装蛋白混合，可在体外包装成有感染力的重组噬菌体颗粒 噬菌体应用：包装范围:36.4Kb-51.5kb 转导效率:lg 重组 DNA 分子获得 10 个以上的噬菌斑.用途:建立 cDNA 基因文库,克隆外源目的基因。 17、酵母人工染色体(YAC) 把酵母染色体与基因复制和表达有关的主要组件都组装在质粒上，令质粒行使酵母的转录功能和复制功能。 特点: 能容纳长达 1000kb-3000kb 的外源 DNA 片段用途: 构建基因组文库，基因治疗和基因功能鉴定。 18、表达载体（expressing vector）表达载体是用

8、来在受体细胞中表达外源基因的载体。表达载体常由克隆载体改造而来。1.3 目的基因20、目的基因的获取方法：（1）酶切法（限制性内切核酸酶酶切） ；（2）化学合成法（由已知氨基酸序列推测可能的 DNA 序列） ；（3）cDNA 文库、基因组 DNA 文库；（4）聚合酶链式反应（PCR ）21、PCR 引物设计原则：（1) 序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以 15-30 bp 为宜。(3) 引物中 G+C 含量通常为 40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度 Tm4(G+C)+2(A+T)；（4）碱基尽可能随机分布。（5）引物内部避免形成二级结构。（6）两引物间避免

9、有互补序列。（7）引物 3端为关键碱基；5端无严格限制22、PCR 反应中的主要成份1. 引物2. 4 种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)3. Mg2+4. 模板5. Taq DNA 聚合酶6. 反应缓冲液 23、基因组 DNA 文库：存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组 DNA 的集合24、cDNA 文库将某种细胞的全部 mRNA 通过逆转合成 cDNA，然后转化宿主细胞，得到含全部表达基因的种群。25、基因的定位诱变利用合成 DNA 和重组 DNA 技术，使已克隆基因或 DNA 片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失变化的过程，是基因工程和蛋白质工程的重要手段。用到的主要技术：

10、寡核苷酸指导的定位诱变 盒式诱变(cassette mutagenesis) PCR 定位诱变1.4 重组体的导入和鉴定26、作为理想宿主的基本要求能高效吸收外源 DNA 分子不具有限制修饰系统应为重组缺陷型菌株根据载体类型选择相应宿主根据载体标记选择合适宿主具有安全性 27、常用的宿主细胞1、大 肠 杆 菌：E.coli 表达体系优势： （1）一种成熟的基因克隆表达的受体细胞（2）繁殖迅速，培养代谢易于控制（3） 易于进行遗传操作和高效表达2、 酵 母：优势：基因结构相对比较简单，便于基因工程操作；培养简单，适于大规模发酵生产，成本低廉；外源基因表达产物能分泌到培养基中，便于产物的提取和加工

11、；不产生毒素，是安全的受体细胞。 3、哺乳类动物细胞哺乳动物细胞表达系统的缺点是，对组织细胞培养技术要求高，培养和筛选细胞株的周期长。4、植物细胞28、外源 DNA 导入宿主细胞方法外源DNA导入原核细胞 外源DNA导入真核细胞转化 转染 感染 酵母细胞 哺乳动物细胞 植物细胞CaCl2 包装蜗牛酶形成原生质体微量注射法电穿孔法磷酸钙共沉淀法原生质体融合法精子介导法微量注射法电穿孔法农杆菌转化基因枪法花粉管法植物转基因常用方法：1、.载体介导转移系统将外源基因重组进入适合的载体系统，通过载体将携带的外源基因导入植物细胞，整合在核染色体组中并随核染色体复制和表达。农杆菌 Ti 质粒（tumor-

12、inducing plasmid）或 Ri 质粒(root-indcing plasmid) 介导法是迄今为止植物基因工程中应用最多、机理最清楚、最理想的载体转移方法。2、基因枪轰击法 将外源 DNA 包裹在微小的钨粉或金粉颗粒的表面，借助高压动力射入受体细胞或组织，最后整合到植物基因组并得以表达3 花粉管通道法 在授粉后向子房注射含目的基因的 DNA 溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源 DNA 导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。1.5、目的克隆的筛选与鉴定29、目的克隆的筛选（1）抗生素抗性选择法（2）插入失活

13、法 （3）-半乳糖苷酶显色反应法（蓝白筛选）30、目的基因序列鉴定（1）菌落原位杂交：是 将 细 菌 从 培 养 平 板 转 移 到 硝 酸 纤 维 素 滤 膜 上 ， 然 后 将 滤 膜 上的 菌 落 裂 菌 以 释 出 DNA。 将 DNA 烘 干 固 定 于 膜 上 与 32P 标 记 的 探 针 杂 交 ，放 射 自 显 影 检 测 菌 落 杂 交 信 号 ， 并 与 平 板 上 的 菌 落 对 位 。（2）限制性酶图谱分析（酶切后，进行 PCR，看是否有目的条带）（3） DNA 序列检测（桑格 双脱氧终止法）31、分子杂交技术Western blot（抗原抗体杂交）原理及步骤： 经

14、过 PAGE 分 离 的 蛋 白 质 样 品 ， 转 移 到 固 相 载 体 （ 例 如 硝 酸 纤维 素 膜 NC 膜 ） 上 ， 固 相 载 体 以 非 共 价 键 形 式 吸 附 蛋 白 质 ， 且 能 保 持 电 泳 分 离 的 多肽 类 型 及 其 生 物 学 活 性 不 变 。 以 固 相 载 体 上 的 蛋 白 质 或 多 肽 作 为 抗 原 ， 与 对 应 的 抗 体 起免 疫 反 应 ， 再 与 酶 或 同 位 素 标 记 的 第 二 抗 体 起 反 应 ， 经 过 底 物 显 色 或 放 射 自 显 影 以 检测 电 泳 分 离 的 特 异 性 目 的 基 因 表 达 的

15、蛋 白 成 分Southern 杂 交DNA 片 段 经 电 泳 分 离 后 ， 从 凝 胶 中 转 移 到 硝 酸 纤 维 素 滤 膜 或 尼 龙 膜 上 ， 然 后 与探 针 杂 交 。 被 检 对 象 为 DNA ， 探 针 为 DNA 或 RNA步 骤 ：Northern 杂 交RNA 片 段 经 电 泳 分 离 后 ， 从 凝 胶 中 转 移 到 硝 酸 纤 维 素 滤 膜 或 尼 龙 膜 上 ， 然 后 与探 针 杂 交 。 被 检 对 象 为 RNA， 探 针 为 DNA 或 RNA步 骤 ：二、氨基酸和蛋白质1、氨基酸等电点：在 某 一 定 PH 溶 液 中 ， 氨 基 酸 所

16、 带 的 正 电 荷 和 负 电 荷 相 等 时 的 PH.2、蛋白质来源：重组人工合成天然蛋白：产量少、成本高；不易分离纯化；易受病原侵染重组蛋白：高表达量、成本低；高纯度；安全。获得重组蛋白的一般方法：（1）离体细胞中表达；（2）转基因植物或动物中表达获得重组蛋白的步骤：（1）分离目的基因 （2）目的基因连接到表达载体 （3）表达载体导入受体细胞 （4）通过发酵培养细胞 （5）分离、纯化目的蛋白 （6）得到目的蛋白3、细菌表达系统的优缺点：优点：1、繁殖速度快 2、蛋白质产量高 3、易培养，花费少 4、仪器成本低缺点：1、无法表达分子量大的蛋白质（50KD） 2、无法去除糖基或信号肽3、真核生物的蛋白质对细菌可能有毒害作用 4、无法很好处理富含 2S 键蛋白质的 S-S4、酵母表达系统的优点：优点如上所述（第 27 题）+