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1、 牛奶中微生物的检测一目的和原理本试验采用标准平板计菌法及显微镜下直接计菌法对不同品质的牛奶中细菌总数进行检测。与此同时，还采用选择性很强的鉴别培养基去氧胆酸盐琼脂平板对牛奶中可能存在的粪便污染指示菌大肠菌群进行检测。这种培养基可抑制绝大多数非大肠菌群细菌的生长，大肠菌群细菌还可发酵培养基中的乳糖产酸，在培养基内指示剂的作用下菌落呈红色，而不发酵乳糖的其它细菌则呈白色，因此很容易加以鉴别并作计数。 牛奶中的微生物，在贮存过程中可不断增殖，同时降低了溶解氧浓度，使氧化还原电位大大下降。我们可用美蓝还原酶试验来检测这一变化，当牛奶因微生物大量增殖而处于厌氧还原环境时，氧化还原指示剂美蓝即被脱色。通
2、过测定牛奶样品中美蓝被还原脱色的速度，即可得知所测牛奶的质量。 二、材料与器皿 (一)培养基 肉膏蛋白胨琼脂培养基 去氧胆酸盐琼脂培养基 培养基配制1.去氧胆酸盐琼脂培养基蛋白胨 10.0g 乳糖 10.0g 去氧胆酸钠 1.0g NaCl 5.0g K2HP04 2.0g 柠檬酸铁 1.0g柠檬酸钠 1.0 g 中性红(1溶液 3ml) 0.03g琼脂 20.0g pH 7.312.肉膏蛋白胨琼脂培养基牛肉膏 0.3g 蛋白胨 1g 氯化钠 0.5g 琼脂 2g 自来水 100mL pH 7.07.2 灭菌 1.05kg/cm2，22min(二)不同质量的生乳各 10ml， (三)显微镜、试
3、管架、水浴锅、铁丝架， (四)灭菌移液管、灭菌 9ml 稀释水试管、载玻片、血球计数移液管、载玻片、无菌带塞试管， (五)试剂-二甲苯、95酒精、1：25，000 美蓝溶液。 三、方法与步骤 (一)牛奶巴斯德消毒法 取生乳 5ml 装试管内，放在 61.7的水浴锅内加热 30 分钟，水平面必须高于牛奶的平面。注意处理时间必须准确，水浴温度要始终一致，并不时摇动试管，使管内牛奶均匀受热。 (二)标准平板计菌法 1、取未经消毒的生奶，充分摇混，使样品呈均匀状态。以十倍稀释法，将生奶稀释成 10-1、10 -2、lO -3、lO -4、10 -5系列， 2、从最大稀释度开始，各取 lmll0-3、1
4、0 -4、10 -5的生奶稀释液，分别放入已标记好的培养皿内：将肉膏蛋白胨琼脂培养基融化，待冷至 45左右时，在火焰旁倒入培养皿内，迅速盖好，放在桌面上轻轻摇转，使稀释的样品与培养基均匀混合，待平板冷却固化后，倒置，于 30培养 2 天。 3、同上方法，吸取 lml10-1、10 -2、10 -3样品稀释液至灭菌培养皿中，分别倾入加热融化并冷至 45的去氧胆酸盐琼脂培养基，冷凝后倒置，30培养 2 天， 24、对经巴斯德法消毒的牛奶作同样的检测，其中细菌总数检测可取 10-2、10 -3样品稀释液，大肠菌群检测可取 10-1、10 -2样品稀释液， 5、所有平板在 30培养 2 天后，选择每皿
5、出现 30300个菌落的稀释度为准，计算出每 ml 牛奶中含细菌总数；根据在去氧胆酸盐琼脂平板上呈红色的菌落数，算出牛奶中大肠菌群细菌数。 (三)显微镜下直接计菌法 1、取洁净载玻片一块，在其上刻好 lcm2面积数块，或用白纸画好 lcm2的面积，将载片放于其上，载片上写好待测样品名称， 2、用无菌的血球计数移液管，准确吸取 0.01ml 待测样品，方法为用嘴吸取样品至 0.01ml 刻度线略为超过一些，然后用吸水滤纸接触吸管的管尖，借助于毛细管作用，吸去多余样品液，使之准确地到达 0.01ml 刻度线处，然后慢慢将样品液吹至载玻片 lcm2面积的中央，3、用接种针，将样品均匀地涂布在 lcm
6、2的面积内，气干，将载片放在铁丝架上，铁丝架置于沸水锅内，用蒸气加热固定5 分钟， 4、将已固定的样品载片放入二甲苯缸内 1 分钟以除去牛奶中的脂肪，然后将载片取出，再放至 95乙醇缸内除去二甲苯，最后将载片放在蒸馏水内除去酒精， 5、用 1：25000 美蓝溶液染色 2 分钟， 6、用水缓慢冲洗样品载片，置空气中干燥后在显微镜(油镜)下计数， 7、计算 30 个视野中细菌的数目，求出每个视野中平均细菌数，乘以常数 500，000 即为每础样品所含细菌数的近似埴。3一般显微镜油浸物镜每个视野的直径为 016mm，每个视野的面积为 0.0002cm2(0.02mm2)，lcm 2中的视野数=10
7、00002=5,000，由于我们以 0.01ml 样品均匀涂布在lcm2面积内，每个视野所复盖的样品量为 1100l5000，亦 1500，000ml 牛奶，因此视野每个细菌代表着每 ml 牛奶中可有 500,000 个细菌。 (四)美蓝还原酶测定法 l、分别用 10ml 无菌移液管从已混匀的待测样品中吸取10ml 牛奶，放入带塞的无菌试管中(体积 15m1)，不同样品各用1 支试管，每种样品同用 1 支移液管，用记号笔编号， 2、每个样品试管内各加 l：25，000 美蓝溶液 lml，塞上瓶塞后充分摇匀，置于 37的水浴内，记录培养时间， 3、每隔半小时观察一次，记录各管美蓝脱色时间，根据表1，判断待测牛奶的质量等级。美蓝脱色时间与牛奶质量等级（表 1）牛奶等级 美蓝脱色时间（小时）上等奶 68中等奶 26下等奶 0.52劣等奶 少于 0.5四、结果与分析将以上检测结果分别填入表 2：标准平板计数(菌落数m1）样品名称细菌总 大肠菌群数显微镜直接计数(菌数m1)美蓝脱色时间(小时)4数12未经消毒生奶（不同产地或不同保存方式）3巴斯德法消毒后牛奶
