《工业微生物实验指导书(林化)》由会员分享，可在线阅读，更多相关《工业微生物实验指导书(林化)（10页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1工业微生物实验指导书（林产化工专业）材料科学与工程学院2实验一 培养基的制备与灭菌一、实验原理马铃薯中含有淀粉、蛋白质、脂类及多种维生素经煮沸后可把这些营养成分从中溶出以供酵母和霉菌生长需要，加入葡萄糖或蔗糖以补充微生物所需的碳源。此培养基为半合成培养基。二、实验目的：1、掌握培养基的制备方法，2、学会高压蒸汽灭菌技术。三、实验材料和仪器：1、马铃薯、葡萄糖（或蔗糖） 、琼脂。2、烧杯、漏斗、试管、三角瓶、量筒、玻璃棒、纱布、棉花、细绳、牛皮纸、试管架、培养皿。3、手提式高压蒸汽灭菌锅、天平、电炉。四、实验方法与步骤：（一）玻璃器皿的清洗配制培养基需要一些玻璃器皿，并且在使用前要对器皿进行清
2、洗、包装和灭菌。新置的玻璃器皿应将其浸在2%的盐酸溶液中数小时；或用热水浸泡，再用去污粉或肥皂粉刷洗，最后经过热水洗涮、自来水冲洗、干燥灭菌备用。用过的玻璃器皿因含有大量的微生物应需先经高压蒸汽灭菌或沸水煮沸30min后，倒掉污物方可洗刷。吸过菌液的吸管，应将其放入盛有5%石炭酸溶液的高玻璃筒内消毒；未吸过菌液的，用水浸泡，防止干燥；吸过油的应在10%的NaOH溶液中浸泡30min，去油后清洗，如去不掉可置于洗液中清洗。吸管上端的棉花用钢针钩出，洗净的吸管顶端向下，下面垫一块干净的厚布或几层纱布，使水分迅速吸干。（二）器皿的包扎试管和三角瓶灭菌前，试管口和瓶口均须塞好棉塞，再在其外面包一层牛皮
3、纸，用棉绳包扎，置于烘箱，灭菌备用。棉塞制作（如下图） （1）要求：棉塞紧贴玻璃管壁，没有皱纹和缝隙，松紧适宜。制作好的棉塞拔出时会听到“叭”的一声响。棉塞长度不小于管口直径的二倍，约2/3棉塞长度进入管口。 （2）作用：棉塞起过滤作用，避免空气中的微生物进入培养基内。3图1-1 棉塞的制作方法洗净的培养皿按1012套一包用报纸，或每10套一起放入特制的铁皮平皿圆筒内，加盖置于烘箱灭菌备用。吸管在包扎前在其前部塞入少许普通棉花，以免使用时将菌液吸出污染或吹入空气污染。塞入的棉花和吸管的管口应保持5mm左右的距离。全长不得超过 10mm。然后把吸管的尖端放在宽58cm 纸条的一端，呈45角折叠纸
4、条，包住尖端，一手捏住管身，一手将吸管压紧再桌面上，向前滚动，以螺旋式包扎，最后打结，灭菌备用。（三）培养基的制备培养基制备的简单过程：配料溶解校正pH 值加凝固剂融化过滤分装加棉塞、包扎灭菌无菌检查1、溶解配料 先在烧杯中放入所需水量的一半，称取培养基配方中的各种原料，依次加入水中溶解，最后补足水分。加入顺序缓冲化合物、主要元素、微量元素最后加维生素等。2、调pH值 在室温下，用精密pH 试纸或酸度计测溶液的 pH值，用酸（6mol/l HCl）或碱(10%NaOH) 调整。加入碱或酸时要搅拌，防止营养成分破坏。3、加凝固剂 将凝固剂加入煮沸的液体中不断搅拌至融化，最后补足水分。4、过滤 在
5、两层纱布中夹入脱脂棉，趁热过滤。5、分装 装入试管中的固体培养基不宜超过试管高度的1/5，装入三角瓶的小于总体积的一半。分装时应避免污染管口培养基的分装见下图7、试管1、过滤漏斗2、铁架3、三角漏斗4、乳胶管5、弹簧夹6、玻璃管图1-2 培养基分装示意图6、包扎 将分装好的试管和三角瓶塞好棉塞，若需好氧培养可以用68层纱布代替棉塞，其上用牛皮纸包好。7、灭菌 将分装灭菌后的琼脂培养基试管置于水平放置的试管上，凝固后即成斜面，斜面长度不得超过试管长度的一半。8、无菌检查 灭菌后的培养基在培养箱中培养 2448 小时作无菌检查。（四）本次实验步骤：1、真菌培养基的制备（1）选无芽、无腐烂的马铃薯、
6、洗净、削皮、称 40g 切碎加水 200ml,放入 1000ml 烧杯中煮沸 0.5hr、冷却用纱布过滤去渣。（2）在清液中加入 4g 葡萄糖溶解补水至 200ml，此时到入一试管 10ml。余下溶液加43.8g 琼脂加热熔化。（3）试管分装：取玻璃漏斗装在漏斗架上，漏斗下连一橡胶管，与玻璃管嘴相接，橡皮管上夹一弹簧夹，培养基倒入漏斗，通过弹簧夹控制培养基的流量。每人两支试管。（4）余下的培养基分装在 250ml 的三角瓶中。（5）高压蒸汽灭菌：把溶解完的培养基用棉塞塞上并用牛皮纸把棉花包住，在 121，0.1Mpa 下灭菌 20min 即可，灭菌时要注意放净阀气。取出灭菌物品时一定要等到压力
7、降到零时打开灭菌锅盖。（6）斜面摆放：将分装灭菌后的琼脂培养基试管置于水平放置的试管上，凝固后即成斜面。（7）培养皿的洗涤与灭菌：培养皿每人两套清洗干净，控干水后用报纸包扎好置于160的烘箱内灭菌 1.5-2 小时，备用。（8）培养皿培养基的倾倒：先用酒精棉球擦拭桌面及双手,在靠近酒精灯火焰的上方把冷却到 45左右的培养基倒入培养皿内，每只倒入 15ml 左右。 。注意：温度太低培养基会凝固。2、细菌培养基的制备取营养琼脂 1.65g 于 250ml 的烧杯中，加水 50ml，加热煮沸溶解，分装在三个试管中，包扎好于 121高压灭菌 15min，取出摆斜面冷却后备用。3、无菌水的制备：用 10
8、ml 的吸管准确吸取 0.9%的生理盐水 9ml 于一洁净的试管中，包扎好于 121高压灭菌 15min，冷却备用。每组 5-6 只试管。4、吸管的包扎与灭菌：取洁净的 1-2ml 的吸管冲洗干净，干燥后在吸管的粗端，放置少许棉花，用报纸包扎好后置于 160的烘箱内灭菌 1.5-2 小时，备用。每组在本组制备的无菌水试管的数量的基础上加一。 五、思考题：1培养基配制好后为什么要灭菌？2蒸汽灭菌应注意几个问题？为什么？实验二 微生物接种和培养一、实验原理 好气性微生物，例如大多数细菌、霉菌、放线菌、藻类、酵母菌和原生动物等，都需要从空气中获得氧气进行有氧呼吸，以氧气作为呼吸基质氧化最终受氢体。空
9、气中不断地供应氧，微生物可彻底地氧化底物，释放出全部能量，以葡萄糖为基质的有氧呼吸可以分作两步进行，一部分是葡萄糖分子分解和脱氢，生成 CO2和还原性氢；另一部分是分子氧被激活，使氧与还原性的氢化合成水。其反应式如下：C6H1206 分解、脱氢脱氢酶2CH3COCOOH+4H葡萄糖（1）2CH3COCOOH+6H2O 分解、脱氢脱氢酶6CO2+20H4H+20H=24H6O2 12O(2)24H+12O 12H2O(3)5二、实验目的1、了解无菌操作在微生物接种过程中的重要性，掌握无菌操作的基本环节。2、掌握几种常用微生物的接种方法，为微生物的形态观察作准备。三、实验材料1、培养物: （1）细
10、菌 大肠杆菌（ Escherichia coli） (2)酵母 酿酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae）(3)霉菌 黑曲霉（ Aspergillus niger）2、培养基（1）营养琼脂固体斜面培养基。（2）真菌培养基：PDA 培养基，液体培养基。3、接种工具（图 2-1）接种针，接种钩，接种环，涂布器，吸管。4、酒精灯，标签纸，火柴，镊子，75%酒精棉球，电炉，无菌平皿。四、实验步骤1.接种步骤：(1).用酒精棉球擦拭手部皮肤及桌面。(2).点燃酒精灯。(3).将菌种和斜面培养基两只试管握在手中平面向上。(4).先将菌种和斜面的棉塞用右手拧松。(5).右手拿接种环，在火
11、焰上将接种环及要进入试管内的部分灼烧灭菌。 图 2-1 接种工具(6).用右手小指、无名指或手掌拔掉棉塞并握紧，不得将棉塞放在桌子上。(7).用火焰灼烧管口，灼烧时应不断转动管口，杀灭沾染在管口上的其他微生物。(8).将烧过的接种环伸入菌种管内，先将接种环接触管壁冷却，然后轻轻接触菌体，取出少许，慢慢将接种环抽出试管，此时不要使环碰到管壁，并且接种环不在通过火焰。(9).迅速将沾有菌种的接种环在火旁伸入斜面培养试管，在培养基斜面上轻轻划直线、点接和画曲线，不要划破培养基，也不要使菌种污染管壁。(10).灼烧试管口，并在火焰旁将棉塞塞上，塞棉塞时不要用试管迎棉塞以免染菌。(11).接种环在火焰上
12、烧红灭菌，放下接种环后，用右手将棉塞塞紧。(12).接种后的试管用标签标明菌种名称、接种日期、时间、接种者的姓名或组号。(13).将斜面放入培养箱内培养，控制温度在 28。2.划线分离：(1).取试管内菌种一环在培养皿内划线。如图 2-1图 2-2 平板划线分离（2）.每画完一次在酒精灯上灼烧接种环一次。（3）.在第一次划线后转动培养皿约 70角，用烧过的接种环通过第一次划线部分作第二6次划线，第三次相同，划线要密不能相互接触，不能划破培养基。3涂布分离：（1）.取一环菌液，接种到 10ml 液体培养基内，培养 24hr。（2）.取 1ml 培养好的菌液进行稀释 10 倍、100 倍、1000
13、 倍。（3）.取后两种浓度溶液各 0.1ml 分别涂布于平面皿上。注意：涂布前一定要灼烧玻璃棒，涂布时一定要冷却玻璃棒。4、斜面接种 用接种环在肉汤斜面培养基上划密波蜿蜒曲线接种大肠杆菌，在 PDA 培养基斜面上用划直线和点接的方法分别接种酵母菌和黒曲霉。5、液体接种：用接种环在肉汤培养基液体中接种细菌，在 PDA 液体培养基中接种酵母菌。液体接种时取一环菌苔，沿管壁轻轻擦下菌苔，塞上棉塞轻摇试管。3、穿刺接种：在肉汤培养基上接种细菌，在 PDA 培养基上接种酵母菌。4、平板接种：分别在不同的培养基平板上点接不同的菌种。五、结果记录1、斜面接种：（1）检查斜面接种情况、绘制斜面生长草图。 （2
14、）分析斜面接种好坏的原因（3）保留斜面、以便观察形态时使用。2、液体接种：观察记录细菌、酵母的液体培养特征，保留酵母液体培养液备用。3、平板接种（1）检查平板接种的生长状况，有无污染（凡没接种地方长出菌落均为染菌） 。（2）描述各个菌落的特征。六、思考题：无菌操作技术体现在操作过程中哪些方面。实验三微生物细胞大小及体积测定一、实验原理应月显微镜的成像原理，同时借助显微镜的镜台测微尺和目镜测微尺，两尺配合使用，进行测量和运算，得出细胞的大小。镜台测微尺系一特制的载玻片（图 31） ，它的中央是一具有刻度的标尺，全长为1mm，共划分为 10 大格，每一大格又分成 10 小格，每一小格长 0.01m
15、m，即 10um。也有全长为 2mm，共分 200 小格，每小格的长度不变。在标尺的外围有一小黒环，以便找到标尺的位置。图 31 镜台测微尺目镜测微尺是放在目镜内的一种标尺，它有固定式和移动式两种类趔。固定式目镜测微尺为一块圆形玻璃片，直径为 2021mm，如图 32 所示。在它的上面刻有各种形式的标尺，有为直线式的（图 3 一 2A） ，有为网式的（图 32B）通常用以测量长度的标尺为直线式的，一般为 5mm，分成 5 大格，每一大格分成 10 小格，共计 50 小格。也有用同样7长度分为 100 小格的。网式目镜测微尺主要用以计算数目和测量物体的面积。在它上面刻有方格的网状标尺。方格的大小
16、和数目各有不同，有 25、36 和 49 格，也有的一个正方形大格中划分 100 个方格，在中央的一个方格中再划分 25 个小方格。A B C D图 32 目镜测微尺A.直线式 B.网式 C.移动式（外形） D.移动式（内部）移动式目镜测微尺基本上和直线式目镜测微尺相似，所不同的是除了泣种固定的标尺外，还有可以移动位置的指示线。它装在一个特别的目镜中右边由一个能旋转的小轮控制着，轮上有刻度，分成 100 格，该轮每旋转一圈，目镜内能移动的指示线就从标尺一端向另一端移动格。显微测量时，先用镜台测微尺标定目镜测微尺每小格代表的长度，然后才能用目镜微尺来测量细胞的长度。二、实验目的：1、学会测微尺的使用和计算方法。2、掌握酵母菌细胞体积的测定方法三、实验材料和仪器：1菌种 酿酒酵母上次实验的液体培养物。2盖玻片、载玻片、显微镜、镜台测微尺、目镜测微尺。3擦
