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1、小鼠组蛋白去乙酰化酶 (HDAC) ELISA 检测试剂盒本试剂仅供研究使用 标本：血清或血浆试验原理：HDAC 试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验(ELISA) .已知 HDAC 浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将 HDAC 和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的 HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物 A、B，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中 HDAC 的浓度呈比例关系。试剂盒内容及其配制试剂盒成份(2-8保存) 96 孔配置 48 孔配置 配制96/48 人份酶标板 1 块板(96T) 半块板(48T) 即用型
2、塑料膜板盖 1 块 半块 即用型标准品：400pmol/L 1 瓶(0.6ml) 1 瓶(0.3ml) 按说明书进行稀稀空白对照 1 瓶(1.0ml) 1 瓶(0.5ml) 即用型标准品稀释缓冲液 1 瓶(5ml) 1 瓶(2.5ml) 即用型生物素标记的抗 HDAC 抗体 1 瓶(6ml) 1 瓶(3.0ml) 即用型亲和链酶素-HRP 1 瓶(10ml) 1 瓶(5.0ml) 即用型洗涤缓冲液 1 瓶(20ml) 1 瓶(10ml) 按说明书进行稀释底物 A 1 瓶(6.0ml) 1 瓶(3.0ml) 即用型底物 B 1 瓶(6.0ml) 1 瓶(3.0ml) 即用型终止液 1 瓶(6.0
3、ml) 1 瓶(3.0ml) 即用型标本稀释液 1 瓶(12ml) 1 瓶(6.0ml) 即用型自备材料1 蒸馏水。2 加样器：5ul、10ul、50ul 、100ul、200ul、500ul、 1000ul。3 振荡器及磁力搅拌器等。安全性1 避免直接接触终止液和底物 A、B。一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。2 实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。3 不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。操作注意事项1 试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。2 实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。3 不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。
4、保质前使用。4 使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物 A、B 液时，避免使用带金属部分的加样器。5 使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。6 洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。7 底物 A 应挥发，避免长时间打开盖子。底物 B 对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取 OD 值。8 加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。9 按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。样品收集、处理及保存方法1、 血清-操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后
5、，1000g 离心 10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。2、 血浆-EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。 1000g 离心 30 分钟去除颗粒。3、 细胞上清液-1000g 离心 10 分钟去除颗粒和聚合物。4、 组织匀浆-将组织加入适量生理盐水捣碎。 1000g 离心 10 分钟，取上清液5、 保存-如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70 保存，避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在 37或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。试剂的准备1 标准品：标准品的系列稀释应在实验时准备，不能储存。稀释前将标准品
6、振荡混匀。稀释比例按下表中进行：400 pmol/L (6 号标准品) 原倍浓度不用稀释直接加入 50ul。200 pmol/L (5 号标准品) 100ul 的原倍标准品加入 100ul 的标准品稀释液100 pmol/L (4 号标准品) 100ul 的 5 号标准品加入 100ul 的标准品稀释液50 pmol/L (3 号标准品) 100ul 的 4 号标准品加入 100ul 的标准品稀释液25 pmol/L (2 号标准品) 100ul 的 3 号标准品加入 100ul 的标准品稀释液12.5 pmol/L (1 号标准品) 100ul 的 2 号标准品加入 100ul 的标准品稀释
7、液0 pmol/L (空白对照) 原始浓度不用稀释直接加入 50ul。2 洗涤缓冲液(50)的稀释：蒸馏水 50 倍稀释。操作步骤1 使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。2 根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液 1：1 稀释后加入 50ul 于反应孔内。3 加入稀释好后的标准品 50ul 于反应孔、加入待测样品 50ul 于反应孔内。立即加入50ul 的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37温育 1 小时。4 甩去
8、孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡 30 秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作 3 次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。5 每孔加入 80ul 的亲和链酶素 -HRP，轻轻振荡混匀，37 温育 30 分钟。6 甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡 30 秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作 3 次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。7 每孔加入底物 A、B 各 50ul，轻轻振荡混匀，37温育 10 分钟。避免光照。8 取出酶标板，迅速加入 50ul 终止液，加入终止液后应立即测定结果。9 在 450nm 波长处测定各孔的 OD 值。建议使用的实验方案标准品浓度(pmol/L)A 40
9、0 400 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品B 200 200 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品C 100 100 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品D 50 50 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品E 25 25 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品F 12.5 12.5 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品G 0 0 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品H 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品
10、局限6 号标准品以上的结果为非线性的，根据此标准曲线无法得到精确的结果。试剂盒性能1. 灵敏度：最小的检测浓度小于 1 号标准品。稀释度的线性。样品线性回归与预期浓度相关系数 R 值为 0.990。2. 特异性：不与其它细胞因子反应。3. 重复性：板内、板间变异系数均小于 10%。结果 判 断 与 分 析1、仪器值：于波长 450nm 的酶标仪上读取各孔的 OD 值2、以吸光度 OD 值为纵坐标(Y) ，相应的 HDAC 标准品浓度为横坐标 (X)，做得相应的曲线，样品的 HDAC 含量可根据其 OD 值由标准曲线换算出相应的浓度。3、检测值范围：0-400pmol/L4、敏感度： 1.0 p
11、mol/L 试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。药品名称：通用名：大鼠组蛋白去乙酰化酶(HDAC)酶联免疫分析试剂盒使用目的：本试剂盒用于测定大鼠血清，血浆及相关液体样本中组蛋白去乙酰化酶(HDAC)含量。实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠组蛋白去乙酰化酶(HDAC)水平。用纯化的大鼠组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入组蛋白去乙酰化酶(HDAC)，再与 HRP 标记的组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。TMB 在 HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成
12、最终的黄色。颜色的深浅和样品中的组蛋白去乙酰化酶(HDAC) 呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度(OD 值)，通过标准曲线计算样品中大鼠组蛋白去乙酰化酶(HDAC)浓度。试剂盒组成1 20 倍浓缩洗涤液 30ml1 瓶 7 终止液 6ml1 瓶2 酶标试剂 6ml1 瓶 8 标准品(180nmol/L) 0.5ml1 瓶3 酶标包被板 12 孔8 条 9 标准品稀释液 1.5ml1 瓶4 样品稀释液 6ml1 瓶 10 说明书 1 份5 显色剂 A 液 6ml1 瓶 11 封板膜 2 张 6 显色剂 B 液 6ml1/瓶 12 密封袋 1 个标本要求1标本采集后尽早进行提取，提
13、取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20保存，但应避免反复冻融2不能检测含 NaN3 的样品，因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。操作步骤1. 标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔 10 孔，在第一、第二孔中分别加标准品 100l，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液 50l，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取 100l 分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50l，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取 50l 弃掉，再各取 50l 分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液 50ul，混匀；混匀后从第
14、五、第六孔中各取 50l 分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液 50l，混匀后从第七、第八孔中分别取 50l 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液 50l，混匀后从第九第十孔中各取 50l 弃掉。(稀释后各孔加样量都为50l，浓度分别为 120nmol/L，80nmol/L ，40nmol/L，20nmol/L， 10nmol/L)。2. 加样：分别设空白孔( 空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液 40l，然后再加待测样品10l(样品最终稀释度为 5 倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量
15、不触及孔壁，轻轻晃动混匀。3. 温育：用封板膜封板后置 37温育 30 分钟。 4. 配液：将 20 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 20 倍稀释后备用5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此重复 5 次，拍干。6. 加酶：每孔加入酶标试剂 50l，空白孔除外。7. 温育：操作同 3。8. 洗涤：操作同 5。9. 显色：每孔先加入显色剂 A50l，再加入显色剂 B50l，轻轻震荡混匀，37 避光显色15 分钟.10. 终止：每孔加终止液 50l，终止反应(此时蓝色立转黄色)。11. 测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度(OD 值)。 测定
16、应在加终止液后 15 分钟以内进行。计算以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与 OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的 OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。注意事项1试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。2浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。3各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。4请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如
