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1、动物细胞染色体荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)FISH（fluorescence in situ hybridization）技术是一种重要的非放射性原位杂交技术，其基本原理是利用被检测的染色体上的靶 DNA 与所用的核酸探针（probes）间的序列同源互补性，经 “变性退火复性”，形成靶 DNA 与核酸探针的杂交体关键词：动物细胞染色体荧光原位杂交 fluorescenceinsituhybridizationFISH 核酸探针 probes实验目的：使学生掌握染色体荧光原位杂交(fluorescence in situ hyb
2、ridization, FISH) 分析技术，了解染色体荧光原位杂交分析技术的应用价值。实验原理：FISH（fluorescence in situ hybridization）技术是一种重要的非放射性原位杂交技术，其基本原理是利用被检测的染色体上的靶 DNA 与所用的核酸探针（probes ）间的序列同源互补性，经“变性退火复性 ”，形成靶 DNA 与核酸探针的杂交体（图 22-1）。核酸探针既可以直接用荧光分子标记，也可以在先标记上报告分子如生物素、地高辛，再使报告分子与荧光素标记的特异亲和素或抗体发生免疫化学反应，最后经荧光显微镜对靶 DNA 进行定性、定量或相对定位分析（图 22-2）
3、。 FISH 是目前进行细胞遗传学研究最为有效的手段，不仅可以研究分析染色体减数分裂过程的行为和不同基因组染色体交叉互换的现象，也是研究基因组分化的重要工具，甚至可以筛选出染色体标记的种特异性重复序列。FISH 为研究染色体上 DNA 的序列提供了一个最直接的方法。具有经济、安全、快速、稳定，灵敏度高等优点。FISH 中使用的探针有：（1）基因组探针（genomic probe）：人类基因组内一些高频率的重复序列，在进化上很少具有保守性。若以基因组 DNA 作为探针，这些存在于探针和靶细胞 DNA 序列中的高度重复序列之间会首先退火结合，越过那些保守的和单一的序列，故杂交会呈现出种特异性。基因
4、组重复序列包括：着丝点重复（Centromere repeats ）、端粒重复（Telomere repeats）、核糖体 DNA（Ribosomal DNA，rDNA）、Interspersed repetitive elements (SINEs, LINEs)等（图 22-3、 4）。（2）染色体特异性序列探针（probe recognizing chromosome specific sequences)：目前在人几乎所有染色体中已经克隆出一些重复序列，重复一百到五千次不等，各具染色体特异性。大多在某一染色体的着丝粒区或异染色质区产生致密的杂交带。从而可特异性地识别某一染色体（图 22
5、-5）。（3）染色体文库探针（chromosome labraries probe）：染色体文库收集人类单条染色体的 DNA 作为探针，又称整体染色体探针。单条染色体的获得一般有两种方法：来自仅携有某一条人类染色体的体细胞杂交株，或经流式细胞分类仪从染色体悬液中分离。（4）单一序列探针（single-copy sequences probe）： FISH 有一弱点，就是要求探针足够大，探针越小，杂交位点检出率就越低。欲利用 FISH 检测存在基因组内的单一序列基因，最有效的方法是应用含大插入片段的克隆载体，如全 Cosmids（载约 40kb 的插入片段），更大的 YAC 载体（载 100-8
6、00kb 插入片段）。若掌握好，小到 2kb 的质粒探针亦可用 FISH 方法定位，但效率较低（图 22-6）。图 22-224 色 mFISH（Multicolor FISH）核型分析技术是近年建立的一种新技术。其原理是使用5 种荧光染料按比例标记探针，杂交后形成 24 条染色体各自呈现特异的荧光色彩以供核型分析（图 22-7，8 ）。为研究人员提供了更丰富详尽的细胞遗传学信息，包括确定标记染色体的来源、检测微小的染色体易位和检测复杂的染色体易位，尤其为肿瘤细胞染色体分析提供了全新、高效的方法。FISH 的应用领域有： (1)基因定位与基因制图（gene mapping）。FISH 已经极大
7、地加速了人类基因定位和基因制图的进程。(2) 基因诊断(gene diagnosis)。精确、直观、明了；(3)间期细胞遗传学（interphase cytogenetics）；(4)FISH 在肿瘤生物学中的应用：肿瘤细胞遗传学（onco-cytogenetics）；基因定位：FISH 可用于分离出的癌基因与抑癌基因初步定位；病毒基因插入基因组部分的检测。利用 FISH 可以检测到病毒整合到人基因组中的情况，对深入研究病毒致癌机理，以及检测、防治肿瘤均具有重要意义；基因的扩增与缺失：原癌基因的激活与抑癌基因的失活是目前肿瘤研究的热点。已知原癌基因的激活方式有：突变、基因扩增、易位、病毒序列插
8、入。抑癌基因的失活方式有：点突变、基因缺失。FISH 为研究基因的扩增和缺失提供了新的方法，能将基因扩增和染色体重复分开。 图 22-3 Telomeres FISH图 22-4 FISH with repetitive probes to human chromosomes(a) FISH with a pan-centromeric probe delineates all centromeres.(b) A probe containing the highly conserved repetitive sequence hybridized to all telomeres. (c)
9、A rDNA probe hybridized to all human NOR bearing chromosomes (chromosome 13-15, 21,22). (d) FISH with the disperse repetitive Alu mimics a R banding pattern.（From：http:/） 图 22-5 Human chromosome 1图 22-6 特异位点定位 BAC FISH图 22-7 24 色染色体 mFISH 核型分析图 22-8实验试剂：1.-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）2.细胞的培养、秋水仙素处理、低渗及固定处理试剂同实
10、验 27。3.端粒 DNA 检测探针： 5-FITC-CCCTAACCCTAACCCTAA-3；FITC 的激发波长为494nm 和发射波长 518nm。探针在合成时，同时进行 5 末端的生物素（biotin ） 、或地高辛（DIG） 、或荧光标记（如FITC、Cy3 等）标记。注意： DNA 探针标记物荧光检测的荧光分子激发和发射波长不能和复染液中 DAPI 染料的激发和发射波长重叠，应有较大差值，避免相互干扰。4.鲑鱼精 DNA（Salmon Sperm DNA）：超声打碎。5.20SSC（ pH7.0）：3M NaCl，0.3M 柠檬酸钠（sodium citrate） ，NaOH 调
11、pH 为7.0，高压灭菌，室温保存。6.甲酰胺（formamyde） （去离子，pure）7.50% 硫酸葡萄糖（ Dextran Solfate）8.250mM 磷酸钠（sodium phosphate）(pH7.0)9.Hybridization buffer：50% deionized formamide, 2SSC, 50 mM sodium phosphate (pH 7.0), 5% dextran sulfate, and 3 ng/ml probe.10.变性液 A：70%甲酰胺，2SSC ，用 1M HCl 调 pH 到 7.0，加入 50mM 磷酸钠以维持 pH。11.漂洗
12、液 A：30%50 甲酰胺， 2SSC；用 1M HCl 调 pH 到 7.0。12.漂洗液 B：0.11SSC；用 1M HCl 调 pH 到 7.0。13.漂洗液 C：2SSC，0.1 Tween20；用 1M HCl 调 pH 到 7.0。14.封闭液：5% BSA 或脱脂奶粉，4SSC15.复染液：2SSC ，0.1 Tween20，200ng/ml DAPI。也可以使用 10 ng/ml 碘化丙锭（PI）或 Hoechst33258（500ng/ml ） 。DAPI，即 4,6-二脒基-2-苯基吲哚（4,6-diamidino-2-phenylindole） 。DAPI 是一种可以穿
13、透细胞膜的蓝色荧光染料。和双链 DNA 结合后可以产生比 DAPI 自身强 20 多倍的荧光。和 EB (ethidium bromide) 相比，对双链 DNA 的染色灵敏度要高很多倍。DAPI 的最大激发波长为 340nm，最大发射波长为 488nm；DAPI 和双链 DNA 结合后，最大激发波长为364nm，最大发射波长为 454nm。 DAPI 溶液用水配制。用于细胞核染色时，推荐的DAPI 工作浓度为 0.5-10g/ml。Hoechst 33258，也称 bisBenzimide H 33258 或 HOE 33258。Hoechst 33258 是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料
14、，对细胞的毒性较低。Hoechst 33258 染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。Hoechst 33258 也常用于普通的细胞核染色，或常规的 DNA 染色。Hoechst 33258 的最大激发波长为 346nm，最大发射波长为 460nm；Hoechst 33258 和双链 DNA 结合后，最大激发波长为 352nm，最大发射波长为 461nm。Hoechst 33258 溶于水，溶解度可达 10mg/ml。 用于细胞核染色时，推荐的Hoechst 33258 工作浓度为 0.510g/ml。16.封片液：2.5% DABOCO 或 1%邻苯胺二盐酸，200
15、mM Tris-HCl, pH8.6, 90%甘油。17.coplin jar：实验步骤：1.从体外培养的贴壁细胞准备的中期染色体标本：A.细胞的培养、秋水仙素处理、低渗处理、固定处理同实验 21。B.载玻片用硫酸洗液浸泡过夜，清洗烘干，在 5% APTES-乙醇溶液中 60处理3h，取出清洗，70干燥备用。C.将固定后的细胞滴于 APTES 修饰的载玻片上, 空气干燥。D.脱水：70%、90%和 100%乙醇脱水，每次 5 min，空气干燥。注意：室温下玻片标本可保存数天到数周；若载玻片要长期保存，应在室温下过夜使组织“老化” （aged） ，然后放入容器中，该容器密封于含干燥剂的塑料袋内，
16、-70保存。-20保存的玻片可在 6 个月内使用；-70可保存一年以上；但标本一旦溶化，则不能在此冷冻。2.染色体标本变性及脱水：A.载玻片静置 60烤箱孵育预热。B.变性液 A 在 水浴中加热至 70。C.将染色体标本载玻片浸入变性液 A 中，70作用 2min。D.脱水：立即将载玻片依次移入冰冷的 70、90及 100乙醇中，各保持 5min。空气干燥玻片。3.探针杂交液的准备（10l/片）：A.1020ng 探针 DNA 和 13g 鲑鱼精 DNA 混合，热块干燥 DNA。B.DNA 中加入 67l 甲酰胺，悬浮 DNA， 保持 30min。C.DNA 溶液中加入 1l 20SSC （终浓度 2SSC） 、2l 硫酸葡萄糖（终浓度 10%） 、1l 2
