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1、 1碧波 TUNEL 细胞凋亡原位检测试剂盒（荧光及显色法） （细胞样本专用）Cat Number： BA2650Specification：50 次Store at: -20 for one year MADE BY BIOBOX碧波 TUNEL 细胞凋亡原位检测试剂盒（荧光及显色法） （细胞样本专用）一、产品简介TUNEL 细胞凋亡原位检测试剂盒（荧光及显色法）(Fluorescence and Colorimetric TUNEL Apoptosis Assay Kit)为您提供了一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法。对于经过固定和洗涤的细胞或组织，只要经过一步染色反应把荧光素连接到
2、凋亡细胞中断裂的 DNA 的 3-OH 末端，洗涤后就可以通过荧光显微镜检测到凋亡细胞；荧光素亦可被抗荧光素抗体(anti-fluorescein antibody)标记，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（ DAB）的存在下，产生很强的颜色反应（呈棕色），因而在普通光学显微镜下即可观察和计数凋亡细胞。细胞在发生凋亡时，会激活一些 DNA 内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组 DNA。细胞凋亡时抽提DNA 进行电泳检测，可以发现 180-200bp 的 DNA ladder。基因组 DNA 断裂时，暴露的 3-OH 可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl
3、 Transferase, TdT)的催化下加上荧光素(FITC)标记的 dUTP(fluorescein-dUTP)，从而可以通过荧光显微镜检测；同时荧光素亦可被抗荧光素抗体(anti-fluorescein antibody)标记，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB）的存在下，产生很强的颜色反应（呈棕色），因而在普通光学显微镜下即可观察和计数凋亡细胞。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有 DNA 的断裂，因而没有 3-OH 形成，很少能够被标记。这就是 TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡的原理。本试剂盒适用于细胞样本（细胞涂
4、片）的凋亡原位检测。本试剂盒有如下优点：1、 高灵敏度：可以在单细胞水平检测到细胞凋亡，同时由于凋亡早期就有 DNA 断裂，可以检测到早期的细胞凋亡。2、特异性：TUNEL 检测时通常更容易标记凋亡细胞，而不容易标记坏死细胞。3、快速：仅需约 3 小时即可完成。4、操作简单：使用 Ready-to-Use 型试剂，并配有 DAB。5、方便观察：可使用荧光显微镜观察实验结果，亦可在信号转换后使用光学显微镜观察实验结果。二、试剂盒组份组 份 Cat: BA2620 Cat: BA2650 Cat: BA26100 储存条件平衡液 1.0 mL 2.5 mL 5.0 mL -20荧光标记液 20L
5、50L 100L -20避光TdT 酶 80L 200L 400L -20anti-fluorescein antibody 10L 25L 50L -20避光DAB 2mg 5mg 10 mg -20避光三、试剂盒以外自备仪器和试剂多聚甲醛、甲醇、乙醇、PBS、H 2O2 、TritonX-100 、柠檬酸钠、复染染液：苏木素或甲基绿等；盖玻片、载玻片、染色缸、染色湿盒、荧光显微镜、光学显微镜、37孵箱、移液器等。四、保存条件：-20保存，荧光标记液和DAB需避光保存。 2五、注意事项：1、TUNEL 法特异性检测细胞凋亡时产生的 DNA 断裂，但不会检测出射线等诱导的 DNA 断裂(和细胞
6、凋亡时的断裂方式不同)。这样一方面可以把凋亡和坏死区分开，另一方面也不会把射线等诱导发生 DNA 断裂的非凋亡细胞判断为凋亡细胞。2、极少数细胞凋亡时没有 DNA 断裂，此时不适用 TUNEL 法检测。在个别类型的坏死细胞中也发现 TUNEL检测呈阳性。在需要严格判断细胞凋亡的情况下，最好同时检测多个凋亡指标。3、使用前请认真阅读本说明书，提前准备好相关试剂。4、因本试剂盒中组分均为微量，使用前请离心。5、为避免试验误差、降低试剂的损耗，建议使用精密度高的进口微量移液枪及枪头。6、 TdT 酶反应液最好在使用前根椐样本数量集中配制，再分别滴加于各样本片上，避免每个样本单独配制而产生的试剂损耗。
7、7、DAB 为固体粉末，使用前加入 PBS 配制成 20DAB（10 mg/ml）后，按说明书显色使用。8、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。六、 操作规程A、 检测样本的预处理TUNEL检测时样本的预处理是试验的关键所在，本说明书推荐的条件仅为普遍情况，用户需根椐自已的样本材料及首次试验结果来调整各个条件，如处理时间、处理浓度等，来优化出适合自身样本的试验条件，从而做出客观的试验结果。1、 对于细胞样本a、 把准备好的细胞涂片或爬片自然晾干。b、 把晾干的样本浸入固定液，室温（15-25）固定15-60min。（固定液的配制：4%多聚甲醛溶于PH7.4的PBS中，需新鲜配制）
8、c、 把固定好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min 。d、 把c 步处理好的样本浸入封闭液中，室温（15-25 ）封闭10min。 （封闭液的配制： 3%H2O2溶于无水甲醇）e、 把d步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min 。f、 把e 步处理好的样本浸入通透液中，冰上（2-8 ）促渗2min 。（通透液的配制：0.1%TritonX-100 溶于0.1%柠檬酸钠，需新鲜配制）g、 然后转入B步骤标记和显色反应。注意事项：a、 为防止样本脱落，请使用硅烷（Silane）处理的载玻片或采用多聚赖氨酸铺片。b、 固定好的样本可以在-20的 70%乙醇中放置30分钟一晚，以改善细胞的渗透
9、性。c、 使用PBS漂洗细胞样本时，不要直接加在细胞样本上，以防止细胞样本的脱落。d、 固定液、PBS、封闭液、通透液、染色缸需用户自备，请按上述方法配制 2、阳性对照及阴性对照的准备TUNEL检测同时需要设阳性和阴性对照，以显示试验的客观性及准确性。因此需要按下述方法准备两 3个样本来制备阳性及阴性片，其后续步聚与待测样本同样进行。a、 阳性对照样本的准备样本在Triton X-100 通透液处理、PBS 浸洗后，再加入 100L DNase I反应液（用户自备）室温37处理10 -30 min，其余步骤均相同。（DNase I反应液的配制：10u-3000u DNase I,40mM Tr
10、is-HCl PH 7.9,10 mM NaCl, 6mM MgCl2, 10mM CaCl2）b、 阴性对照样本的准备在标记反应的过程中不添加TdT酶反应液，其余步骤均相同。B、标记和显色反应：1、 预处理好的样本 PBS 漂洗 2 次，每次 5min 后，样本周围用滤纸或吸水纸吸干。2、 配制 TdT 酶反应液：参考下表配制适当量的 TdT 酶反应液（根据需要按照比例放大） ，需充分混匀。注意：配制好的 TdT酶反应液必须一次使用完毕，不能冻存。1个样品 5个样品 10个样品平衡液 45l 225l 450l荧光标记液 1l 5l 10lTdT 酶 4l 20l 40lTdT 酶反应液总体
11、积 50l 250l 500l3、 每个样本滴加 50L TdT 酶反应液，加盖玻片 37避光湿润反应 60min。 （阴性对照片不加 TdT 酶）4、 把第3步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min 。5、 荧光显微镜下观察，可以使用的激发波长范围为 450-500nm，发射波长范围为 515-565nm(绿色荧光)。可进一步用 DAB 进行染色观察6、 anti-fluorescein antibody 及 DAB 工作液的配制： anti-fluorescein antibody工作液的配制：参考下表配制适量的anti-fluorescein antibody工作液，需充分混匀。注
12、意：配制好的anti-fluorescein antibody工作液必须一次使用完毕，不宜冻存。1个样品 5个样品 10个样品anti-fluorescein antibody 0.5l 2.5l 5lPBS 99.5l 497.5l 995lanti-fluorescein antibody 工作液总体积 100l 500l 1000lDAB 工作液的配制：a、先把试剂盒中 DAB 粉末用 PBS 溶解配制成 20DAB（10 mg/ml） ，配制方法如下：DAB 2mg 5mg 10mgPBS 0.2ml 0.5ml 1.0ml配制成 20DAB（10 mg/ml） ，放于-20保存 4b
13、、DAB 工作液的配制：参考下表配制适量的DAB工作液，需充分混匀。注意：配制好的DAB工作液必须一次使用完毕，不宜冻存。1个样品 5个样品 10个样品20DAB（10 mg/ml） 5l 25l 50l30H 2O2 1l 5l 10lPBS 94l 470l 940DAB 工作液总体积 100l 500l 1000l7、 将第 5 步处理好的样本周围用滤纸或吸水纸吸干，再滴加 50L-100L anti-fluorescein antibody 工作液，加盖玻片 37湿润避光反应 30min。8、 把第 7 步处理好的样本浸入 PBS 漂洗 3 次，每次 5min，样本周围用滤纸或吸水纸吸干。9、 将第 8 步处理好的样本滴加 50L-100L DAB 工作液，室温孵育 5-30 分钟或根据显色情况孵育适当时间。注意：如果显色很强可以短于 5 分钟即停止显色，如果显色很弱，可以适当延长显色时间，甚至显色过夜。10、 把第 9 步处理好的样本浸入 PBS 漂洗 3 次，每次 5min，可直接光学显微镜下观察、拍照。11、 选做(本步骤可不做)：用苏木素染色液或甲基绿染色液进行细胞核染色。随后用 PBS 漂洗 3 次，每次5min，光学显微镜下观察、拍照。操
