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1、实验五 微生物大小测定和显微镜直接计数一、实验目的：1、了解显微测微尺的结构；2、掌握显微测微尺用于测量菌体的方法；3、学习使用血细胞计数板计算酵母细胞数的原理和方法；4、了解微生物活体染色的原理的技术的方法。二、实验原理：1、显微测微尺可用于测量微生物细胞或孢子的大小，包括镜台测微尺和目镜测微尺两个部件。镜台测微尺全长 1mm，等分为 100 格，每格 0.01mm。用于校正目镜测微尺没小哥的长度.目镜测微尺其中央刻有 50 等分或 100 等分的小格 .测量前应预先用镜台测微尺来校正并计算出在某一放大镜下,目镜测微尺每小格所代表的实际长度,再以后作为测量微生物细胞的长度.目镜测微尺每格长度
2、/m = 两条重合线间镜台测微尺的格数10/两条重合线间目镜测微尺的格数 2、利用血球计数板直接在显微镜下计数微生物的细胞（或孢子）数目。优点：直观、快速、操作简便，其缺点为：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察1ml 菌液中的总菌数 =（5 个方格中的总菌数/5 ）25104 稀释倍数本实验中暂规定：计上不计下，计左不计右，即位于本格上线和左线上的细胞计入本格，本格的下线和右线上的细胞按规定计入相应的格中三、实验步骤：（一）微生物大小的测定：1、放置目镜测微尺：取出目镜，旋开目透镜，目镜测微尺放在光阑上，旋上目镜，将目镜插入镜筒2、
3、将镜台测微尺放在井台上，调焦看清镜台测微尺的刻度3、低倍镜下使镜台测微尺与目镜测微尺刻度平行，一段起止线重合，分别数出格数并求出目镜测微尺每小格的实际长度，同样的方法在高倍镜下重复进行4、按公式计算目镜测微尺每格的长度5、测量菌体的大小：取下镜台测微尺，制作酵母菌涂片，分别在低倍镜、高倍镜下测量10 个菌体的长宽，求其平均值，用长（m)*宽（m）表示（二）显微镜直接计数1、制备酵母菌的稀释液，将菌液稀释 10 倍2、将计数板的盖玻片放在计数室上面的两边平台架上，混匀后酵母菌悬液吸取滴加在盖玻片与计数板的边缘缝隙处，待菌液渗入计数室，菌体自然沉降与稳定后计数3、在计数室移至视野中央，选取 25
4、中格（4 觉与中央）计含菌数，重复计数 2-4 个计数室内的含菌量，求其平均值。四、材料和器皿：酵母菌液，显微镜，镜台测微尺，目镜测微尺，擦镜纸，二甲苯，血细胞计数板，配套的计数板厚盖玻片，试管，移液管，吸水纸。五、实验结果：10 倍镜下目镜测微尺的实际每个长度：（5/10 ）10=5um；40 倍镜下目镜测微尺每格的实际长度：（10/80 ）10=1.25um。分别列表 5 个酵母菌的长和宽，计算其平均值（10 倍镜下）1 2 3 4 5 平均值长 1.8 1.5 1.0 2.4 2.0 1.7实际长度 9.0 7.5 5.0 12.0 10.0宽 2.0 1.6 1.2 2.2 2.4 1
5、.1实际宽度 10.0 8.0 6.0 11.0 12.0 分别列表 5 个酵母菌的长和宽，计算其平均值（40 倍镜下）1 2 3 4 5 平均值长 7.2 9.2 8.3 6.8 7.4 7.8实际长度 9.0 11.5 10.4 8.5 9.3 9.6宽 6.9 9.0 8.0 7.2 7.0 7.6实际宽度 8.6 11.3 10.0 9.0 8.8 9.5长（m）9.6 宽（m）9.5大小（m2） =9.6*9.5计菌总数中格菌数 大格总菌数 稀释倍数 菌数（个/mL）x1 x2 x3 x4 x5 （平均值）第一室 17 39 29 23 30 29 10 7107 第二室 32 36
6、 30 24 28 30 10 7.5107 结果分析：1）10 倍镜和 40 倍镜的放大精确度不同。2）血细胞板计数所计数的有活菌、有死菌，结果代表总的细菌值。3）此计数法采用计上不计下，计左不计右的原则。六、回答问题1、在某架显微镜下使用某一放大倍数的物镜，测得目镜测微尺的每个实际长度，当换一架显微镜用同样放大倍数的物镜时，该尺度是否还有效？为什么？1、答：无效，显微镜与显微镜之间目镜的放大倍数，或物镜的放大倍数间有一定误差。虽都标有 10*或 40*，但可能由于制造过程的误差，会出现不同的放大倍数，其次由于人眼观察造成误差，显微镜下两线平行并重合，会因不同人的观察时间的不同引起读数不一致
7、，因此在第一次测得每格实际长度后，换一架显微镜即使为同样倍数的物镜，该尺度无效需要重新测量。2、试分析影响本实验的误差来源及提出改进措施 。2、答：误差来源可能为样品没有摇匀计数室内有气泡读数因人而异样品小室有液体流动或器材上留有菌液，细胞识别错误等。可采用的措施包括样品一定要摇均匀，如果有气泡就一定要重新做读数时速度要快所用器材均应清洁干燥，应等样品小室内液体稳定后再进行读数，并对细胞进行正确的识别。同时也有可能是由于滴加的液体样品较少，没有充满样品市，在计数时计数室的 样品数不均匀，造成 计数偏差。七.总结与分析:再用显微测微尺测量酵母菌的大小时，由于做好片子后没有用吸水纸吸去多余的液体，造成片子中的酵母细胞呈流动状态，因此误差较大。
