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1、1植物乙酰辅酶 A 羧化酶（ACC）酶联免疫分析(ELISA)试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用 目的：本试剂盒用于测定植物组织，细胞及相关液体样本中乙酰辅酶 A 羧化酶（ACC）的活性。实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中植物乙酰辅酶 A 羧化酶（ACC）水平。用纯化的植物乙酰辅酶 A 羧化酶（ ACC）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入乙酰辅酶 A 羧化酶（ ACC） ，再与 HRP 标记的乙酰辅酶 A 羧化酶（ACC）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最
2、终的黄色。颜色的深浅和样品中的乙酰辅酶 A 羧化酶（ACC ）呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（OD 值） ，通过标准曲线计算样品中植物乙酰辅酶 A 羧化酶（ACC ）活性。试剂盒组成：试剂盒组成 48 孔配置 96 孔配置 保存说明书 1 份 1 份封板膜 2 片（48） 2 片（96）密封袋 1 个 1 个酶标包被板 148 196 2-8 保存标准品：2700 U/L 0.5ml1 瓶 0.5ml1 瓶 2-8 保存标准品稀释液 1.5ml1 瓶 1.5ml1 瓶 2-8 保存酶标试剂 3 ml1 瓶 6 ml1 瓶 2-8 保存样品稀释液 3 ml1 瓶 6 ml1
3、瓶 2-8 保存显色剂 A 液 3 ml1 瓶 6 ml1 瓶 2-8 保存显色剂 B 液 3 ml1 瓶 6 ml1 瓶 2-8 保存终止液 3ml1 瓶 6ml1 瓶 2-8 保存浓缩洗涤液 （20ml20 倍）1 瓶 （20ml30 倍）1 瓶 2-8 保存样本处理及要求：1. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分） 。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用 PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到 100 万/ml 左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心 20分钟左右（2000-3000 转/分）
4、。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。2. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的 PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持 2-8的温度。加入一定量的 PBS（PH7.4） ，用手工或匀浆2器将标本匀浆充分。离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分） 。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。3. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20保存，但应避免反复冻融.4. 不能检测含 NaN3 的样品，因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP ）活性。操作步骤：1. 标准品的稀
5、释与加样：在酶标包被板上设标准品孔 10 孔，在第一、第二孔中分别加标准品 100l，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液 50l，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取 100l 分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50l，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取 50l 弃掉，再各取 50l 分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液 50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取 50l 分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50l，混匀后从第七、第八孔中分别取 50l 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液 50l，混匀后从第九
6、第十孔中各取 50l 弃掉。 （稀释后各孔加样量都为 50l，浓度分别为 1800 U/L，1200 U/L，600 U/L，300 U/L， 150 U/L） 。2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同） 、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液 40l，然后再加待测样品10l（样品最终稀释度为 5 倍） 。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。3. 温育：用封板膜封板后置 37温育 30 分钟。4. 配液：将 30（48T 的 20 倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30（48T 的 20 倍）倍稀释后备用。5. 洗涤：小心揭掉封板
7、膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此重复 5 次，拍干。6. 加酶：每孔加入酶标试剂 50l，空白孔除外。7. 温育：操作同 3。8. 洗涤：操作同 5。9. 显色：每孔先加入显色剂 A50l，再加入显色剂 B50l，轻轻震荡混匀，37避光显色15 分钟. 10. 终止：每孔加终止液 50l，终止反应（此时蓝色立转黄色） 。11. 测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值） 。 测定应在加终止液后 15 分钟以内进行。注意事项：1 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存
8、。2 浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。3 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。4 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本 OD值大于标准品孔第一孔的 OD 值） ，请先用样品稀释液稀释一定倍数（ n 倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（n5） 。5 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。36 底物请避光保存。7 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.8 所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。9 本试
9、剂不同批号组分不得混用。10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。计算：以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标， 在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的 OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释 倍数；或用标准物的浓度与 OD 值计算出标 准曲线的直线回归方程式，将样品的 OD 值 代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释 倍数，即为样品的实际浓度。 （此图仅供参考）试剂盒性能：1.样品线性回归与预期浓度相关系数 R 值为 0.92 以上。2.批内与批见应分别小于 9%和 15%检测范围： 40 U/L -2200 U/L 保存条件及有效期：1.试剂盒保存：；2-8。2有效期：6 个月4F
10、OR RESEARCH USE ONLYPlant ACCDrug NamesGeneric Name： Plant ACC ELISA Kit.PurposeThis kit allows for the determination of ACC in Plant tissue, cell culture supernatant and other biological fluids.Principle of the assayThe kit assay Plant ACC level in the sample，use Purified Plant ACC to coat microtit
11、er plate wells, make solid-phase antibody, then add ACC to wells, Combined ACC which With HRP labeled ， become antibody - antigen - enzyme-antibody complex, after washing Completely, Add TMB substrate solution,TMB substrate becomes blue color At HRP enzyme-catalyzed, reaction is terminated by the ad
12、dition of a sulphuric acid solution and the color change is measured spectrophotometrically at a wavelength of 450 nm. The concentration of ACC in the samples is then determined by comparing the O.D. of the samples to the standard curve.5Materials provided with the kitMaterials provided with the kit
13、 48determinations 96 determinations StorageUser manual 1 1Closure plate membrane 2 2Sealed bags 1 1Microelisa stripplate 1 1 2-8Standard：2700U/L 0.5ml1 bottle 0.5ml1 bottle 2-8Standard diluent 1.5ml1 bottle 1.5ml1 bottle 2-8HRP-Conjugate reagent 3ml1 bottle 6ml1 bottle 2-8Sample diluent 3ml1 bottle
14、6ml1 bottle 2-8Chromogen Solution A 3ml1 bottle 6ml1 bottle 2-8Chromogen Solution B 3ml1 bottle 6ml1 bottle 2-8Stop Solution 3ml1 bottle 6ml1 bottle 2-8wash solution （20ml20 fold）1bottle （20ml30 fold）1bottle 2-8Specimen requirements1. cell culture supernatant-detect secretory components, collect sue
15、 a sterile container, centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m. remove supernatant,detect the composition of cells, Dilut cell suspension with PBS（PH7.2-7.4）, Cell concentration reached 1 million / ml, repeated freeze-thaw cycles, damage cells and release of intracellular components, centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m. remove supernatant, If precipitation appeared, Centrifugal again.2. Tissue samples- After cutting samples, check the weight,add PBS（PH7.2-7.4）, Rapidly frozen with liquid nitrogen, maintain samples at
