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1、抗幽门螺杆菌黏附素 A 卵黄抗体的制备及评估 曾波 张忠宝 张智 孙礼进 陈咏梅 曹谦 钱颖 李再新 四川理工学院化学工程学院 四川理工学院生物工程学院 摘 要： 目的 制备及评估一种以幽门螺杆菌黏附素 A (HpaA) 为靶点的特异性卵黄抗体。方法 脲酶阳性胃黏膜样本采自富顺县人民医院, 微需氧条件下分离培养幽门螺杆菌;PCR 扩增 HpaA 片段, 原核表达形式获得 HpaA 重组蛋白并以 Western blot检测其抗原性;与弗氏佐剂充分乳化后免疫产蛋鸡, 水稀释-盐析法纯化卵黄抗体;SDS-PAGE、ELISA 及 Dot blot 分析其生物学特性并评估对分离株体外生长的抑制效果。
2、结果 分离株脲酶、氧化酶、触酶反应阳性;HpaA 片段长 702 bp, 重组 HpaA 蛋白相对分子质量约为 45 000, 可溶形式表达且具有良好的抗原性;以其制备的 IgY-HpaA 滴度高达 1150 000, 11 000 稀释后仍能良好地识别分离株, 5 mg/ml 剂量可显著抑制分离株的生长。结论 以 HpaA 为靶点制备的卵黄抗体在体外可特异性识别并抑制幽门螺杆菌的生长。关键词： 幽门螺杆菌; 黏附素 A; 卵黄抗体; 原核表达; 抑菌效果; 作者简介：李再新, E-mail:收稿日期：2017-08-18基金：四川省科技厅人才创新计划 (2017RZ0083) Prepara
3、tion and characterization of specific IgY against Helicobacter pylori adhesin AZENG Bo ZHANG Zhongbao ZHANG Zhi SUN Lijin CHEN Yongmei CAO Qian QIAN Ying LI Zaixin School of Chemical Engineering, Sichuan University of Science Department of Biological Engineering, Sichuan University of Science Abstra
4、ct： Helicobacter pylori (Hp) is known as the main cause of gastritis disorder, but traditional antibiotic therapy against Hp infection is challenged by the increasing tolerance.A high-targeted egg yolk antibody (IgY) has expected to be a mean of passive immunization therapy for Hp infections.Here, a
5、 specific IgY targeting to Hp adhesion-A (IgY-HpaA) was prepared and evaluated.In brief, a urease-, oxidase-, catalase-positive strain was isolated from a suspected Hp infected patient, and hpa A partial gene (702 bp) was amplified from the isolated strain using PCR reaction with a specific primer.R
6、ecombinant HpaA protein, molecular weight is about 45 KDa, was expressed as soluble protein in the E.coli prokaryotic expression system and then purified from supernatant through Ni2+-NTA affinity chromatography, and its antigenicity was identified by Western blotting with anti-Hp IgY.Anti-HpaA vacc
7、ine was prepared from the emulsion of r HpaA protein with the same volume of Freunds adjuvant.7 days after immunizing chickens, IgY-HpaA was extracted from yolk using water dilution and sodium chloride precipitation.The purity and titer of IgY-HpaA, evaluated by SDS-PAGE and ELISA, reached to 95% an
8、d 1150 000 respectively.A specific recognition of IgY-HpaA to Hp still been detected although diluted by 1 000 times.Remarkably, the growth of Hp can be suppressed significantly by IgY-HpaA at 5 mg/ml in vitro.In summary, the prepared IgY-HpaA possesses a high specificrecognition and growth inhibiti
9、on to Hp in vitro.Keyword： Helicobacter pylori; Adhesion A; Egg yolk antibody; Prokaryotic expression Antibacterial effect; Received： 2017-08-18幽门螺杆菌 (Helicobacter pylori, Hp) 是一种寄生于胃黏膜层的革兰氏阴性细菌1, 直接参与了慢性胃炎、胃溃疡的发生与发展, 是胃腺癌、胃黏膜相关淋巴样组织 (MALT) 淋巴瘤的潜在诱发因子2-3。据统计, 全球近一半的人群患有 Hp 感染, 我国自然人群中 Hp 的感染率高达 56%4
10、-5。目前, 临床上主要以阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑及奥美拉唑等抗菌药物的联合使用治疗 Hp 的感染6, 但“三联”或“四联”疗法易引起恶心、食欲不振等不良反应7;治疗过程中出现的适应性耐药以及根除失败后引起的获得性耐药等问题越来越严重8;此外, 多种抗生素联用破坏了消化道菌群 (特别是肠道菌群) 的正常结构, 易引起腹泻、消化不良等症状9。卵黄抗体是禽类卵黄中靶向性强、副作用低、无耐药性的免疫球蛋白, 在病毒性腹泻、胃肠道疾病治疗和消毒防御等方面有着较为普遍的应用, 并作为一种新的被动免疫疗法用于预防和治疗 Hp 感染10-11。Hpa A (Helicobacter pylori adhe
11、sion A) 是 Hp 黏附素群的核心成分, 对 Hp体内定植具有极为重要的意义12。Hp 感染者血清中 Hpa A 抗体的检出率高达86%, 显著高于热休克蛋白 (68%) 和细胞空泡毒素 (68%) 13。本研究通过从临床上分离出 1 株野生型 Hp (WT-Hp) , 经体外重组及免疫学技术获得了可高特异性识别 Hp 且抑菌效果显著的抗 Hpa A 卵黄抗体, 为进一步探讨抗 Hpa A 卵黄抗体对于 Hp 体内清除的临床可实现性奠定了基础。1 材料与方法1.1 材料与试剂Columbia 培养基 (山东西亚试剂) ;Hp 培养基添加剂 (含 1 mg/ml 万古霉素, 2 mg/ml
12、 甲氧苄啶, 0.5 mg/ml 两性霉素 B, 1 mg/ml 头孢磺啶) 和氧化酶试纸 (青岛海博生物) ;微需氧产生装置 (美国 Gene Science) ;基因组抽提试剂盒 (德国 QIAgen) ;硝酸纤维素膜 (美国 Millipore) ;二抗 (HRP 标记的山羊抗鸡Ig Y) 、完全/不完全弗氏佐剂 (美国 Sigma) ;胎牛血清、Ni-NTA 亲和层析 (美国 Invitrogen) ;鸡抗 Hp Ig Y (Ig Y-Hp) 由本实验室制备;其他化学试剂均为分析纯;海兰白蛋鸡苗购自自贡市某鸡场。1.2 样本收集、培养及基因组 DNA 抽提胃黏膜样本取自富顺县人民医院胃
13、肠镜科, 患者胃炎史长达 3 年且 C-呼气试验阳性, 对本研究知情同意。活检钳于无菌条件下取出病灶组织 (1 mm1 mm5 mm) , 剪碎后涂板于哥伦比亚血琼脂培养基上 (含 7%胎牛血清及 1%抗生素添加剂) , 37微需氧条件下培养 (N 2:85%, O2:10%, CO2:5%, 湿度:50%RH) 。培养至 5 d 左右, 挑取与 Hp 相似的菌落做纯种培养。收集菌体, 取少量用于脲酶、氧化酶、触酶生化分析。另取部分菌体抽提基因组 DNA, 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测质量。1.3 Hpa A 重组蛋白的表达hpa A 扩增引物为 hpa A-F:5-CCGGAATTC (Eco
14、 R I) TGCAGCCCGCAT ATTA-3;hpa A-R:5-CCGCTCGAG (Xho) TTA TCGGTTTCTCTTG-3。取 10 ng 抽提的基因组 DNA 作为模板, 配制 50l PCR 体系, 另含前后引物各 20mol/L, 10 mmol/L Tris-HCl (p H=8.3) , 50 mmol/L KCl, 1.5 mmol/L Mg, 1 mmol/L d NTPs 以及 0.1 U pfu 聚合酶。扩增条件为 95预变性 5 min;共 35 次循环;94变性 45 s, 58退火 50 s, 72延伸 2 min;循环结束后 72再次延伸 5 mi
15、n。1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。回收 PCR 产物, 经 Eco R和Xho双酶切后与 p ET32a 双酶切产物 16过夜连接。将连接产物转入 E.coli TOP10 感受态细胞内, 涂板于 LA 固体培养基上 (含1Amp 的固体 LB 培养基) 。37过夜培养后, 挑取单菌落接种于 5 ml LA 液体培养基中, 37摇床培养 8 h。提取质粒并送由华大基因测序。将阳性重组质粒转入 E.coli BL21 (DE3) Plys S 感受态细胞中, 37平板培养过夜后挑取单菌落接种于 50 ml LA 液体培养基中。37200 r/min 摇床培养至OD600 nm值介于 0.
16、6 到 0.8 之间, 以终浓度 1 mmol/L 的 IPTG、26继续培养 6 h 诱导表达。收集菌体重悬于 15 ml 裂解缓冲液 (含溶菌酶 1 mg/ml) , 4酶解 1 h。超声 (100 W, 超声 6 s, 间隔 3 s, 共 5 min) 裂解菌体。收集上清和沉淀, SDS-PAGE 电泳分析。1.4 可溶性 Hpa A 重组蛋白的纯化及抗原性检测Ni-NTA 琼脂糖凝胶经 10 mmol/L 咪唑 (p H=8) 预先平衡后加入裂解上清中, 低温低速搅拌 2.5 h, 1 500 g 离心 2 min。20 mmol/L 咪唑 (p H=6) 洗涤沉淀, 重复 3 次。500 mmol/L 咪唑 (p H=8) 洗脱。PBS 透析除去产物中的咪唑, 12%SDS-PAGE 检测纯度。Western blotting 分析 Hpa A 重组蛋白的抗原性。具体而言, 将纯化后的 Hpa A 重组蛋白以
