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1、1教案首页第_3_次课 授课时间： 2006 年 11 月 13 日11 月 17日课程名称 生物化学与分子生物学实验课 年级 2005 专业、层次 临床医学本科授课教师 符伟玉 职称 讲师 课 型(大、小) 小 学时 3授课题目（章、节） 实验三 聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清脂蛋白基本教材或主要参考书 自编 生物化学与分子生物学实验指导教学目的与要求：1、掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，了解其操作方法。2、了解血清脂蛋白各组分的分离情况。大体内容与时间安排，教学方法：1、聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理 5min2、聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作步骤及示范 10min3、聚丙烯酰胺凝胶电泳的注意事项 5m
2、in4、学生做实验 140min教学方法：实验+示教教学重点、难点：重点：1、聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理2、聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作步骤难点：1、聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理2、实验操作中的灌胶和点样教研室审阅意见：教研室主任签名：年 月 日3基本内容 辅助手段和时间 分配4一、实验原理（一）浓缩效应在 pH=6.7 的浓缩胶中带电粒子的泳动速度为: Cl- proteinGly，蛋白质样品夹在 Cl-和 Gly 之间被挤压成一条狭窄的区带 ,使蛋白质样品浓缩。（二）电荷效应不同蛋白质 pI 不同，在相同 pH 值下所带电荷不同，因此在相同电场强度作用下，在电场中的移动（泳动）速度不同，可以根据这一
3、效应把蛋白质分成不同的区带。（三）分子筛效应所聚合形成的 PAG 为多孔网状结构，对大分子物质的穿透有一定阻力，蛋白质在通过具有均一孔径的凝胶时，因颗粒大小不同，形状规则程度不同，所受阻力也不相同。利用本效应也可以将蛋白质分离为不同的区带。颗粒大形状不规则的分子阻力 电泳 v 颗粒小, 球形分子阻力 电泳 v 将血清脂蛋白用苏丹黑 B 丙二醇预染，加于聚丙烯酰胺凝胶柱上进行电泳。由于聚丙烯酰胺凝胶电泳具有浓缩效应、电荷效应和分子筛效应，因此它的分辨率高，可将血清脂蛋白各组分清晰分开。二、操作步骤（改动）1、第 1 步改为：将清洁的 0.57.5cm 玻璃管（1 支/2 人） ，一端套上带有玻璃
4、珠的橡皮管（同时滴入 2 滴蔗糖并检查有无漏水）垂直插在小试管上，以备制胶。从冰箱中取出下列试剂，在室温中平衡，然后在一小烧杯中依此加入。2、第 2 步：迅速用吸管吸取上述混合液沿管柱注入玻管中，每管 0.8ml-1.0ml，随即用滴管经针头沿管壁缓慢加入蒸馏水约 0.5cm 高度以隔氧；改为迅速用吸管吸取上述混合液沿管壁柱注入玻管中至离管口 1cm，加满蒸馏水以隔氧。3、第 3 步然后取预染血清 50l 加在凝胶面上，再沿管壁缓慢加入电泳液直至管的顶端，改为沿管壁缓慢加入电泳液直至管的顶端，用 200l 枪取预染血清 50l 加在凝胶面上；删除取血清 0.2ml，加苏丹黑 B 丙二醇液 0.
5、02ml，加25%蔗糖溶液 0.02ml，混匀，室温放置 45min 后, 2000r/min 离心 5min。4、第 4 步，电流为 25mA/ 管，待第一色带到达胶管下段约 1cm 时停止电泳；改为电流为 6mA/管，待第一色带到达胶管下段约 2cm 时停止电泳。三、注意事项1、丙烯酰胺和甲叉双丙烯胺是神经性毒剂，过硫酸铵为有毒成份，并对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触（漏胶时不要用手接触） 。大量操作时应在通风橱中进行。2、丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺溶液应装在棕色瓶中，置冰箱内(4)保存。可贮存 12 月。测定 pH 值(4.95.2)可检查其是否失效。失效液不能聚合。3、TEMED 要密
6、封保存，过硫酸铵溶液最好当天配制，以防止氧化失效。4、配胶取样要准确，最后加过硫酸铵，加完后轻轻混合（关键） ；5、配好胶后应于尽快灌胶（不要形成气泡） ，5 分钟内完成装柱，清洗仪器；6、切记装柱后立即用蒸馏水封闭；灌胶和电泳时要注意排除气泡；7、加样时注意不能损伤已聚合的凝胶表面；8、电泳时凝胶管不能漏水,并且与电泳槽垂直；凝胶和滤纸请放入垃圾桶中，勿直接倒入水池9、电泳时间不能过久，待第一条色带到达玻璃管下端约 2cm 时停止电泳，否则色带会变宽。5min示意图示意图示意图10min5min实验+示教140min1小 结实验利用聚烯酰胺凝胶作电泳支持物。电荷和分子大小不一的各种血清蛋白质通过浓缩效应、电荷效应、分子筛效应而被精细地分离。由于具有以上三种效应，所以此方法分离效果好，分辨率高。兔血清蛋白在聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳中可分出 34 个组份。复习思考题、作业题1、正常空腹血清脂蛋白电泳可出现哪些区带？将本实验的电泳图谱与血清琼脂糖凝胶电泳图谱比较并解释。2、聚烯酰胺凝胶电泳分离出的各种血清脂蛋白是否为均一物质？为什么？下次课预 习要 点分子筛层析（凝胶过滤）的原理、操作过程及注意事项。实 施情况及分 析
