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1、第二章 生物技术与生物制品学的新进展第一节 世界总的特点一、基础研究不断深入1、新基因的克隆和基因表达调控的研究全面展开；2、以 DNA、RNA 和蛋白质为轴心的分子生物学理论和技术两大体系已基本完成。3、DNA 转化和测序也得到应用，开创了生物科学的一个新时代，使生物各学科都进入了分子生物学时代。4、利用生物技术能有效地研制出对付各种“不治之症”的新药，因而它正吸引和激励着越来越多的科学家进行医药生物技术的基础和应用研究。 5、人类基因组的研究目标，就是要定位所有的基因和测定它们的核苷酸序列。二、新产品不断出现1、生物技术药物的品种不断增多，包括基因工程 疫苗、细胞因子等。2、研制了新一代生
2、物技术药物与生物制品，并更新了应用方法。3、生物技术药物和生物制品的生产方法取得了进展.4、利用基因工程技术构建新型多价活疫苗，是生物技术的又一个新进展。 三、新技术、新试剂不断出现1、产生了两种医疗技术：细胞移植和基因治疗2、生物试剂的开发。（1）单抗的主要优点1）高度同质性：单抗是由源于一个 B 淋巴细胞的单克隆杂交瘤细胞系所分泌的，因此抗体分子是同质的，即完全一样的；而多抗是由多种异质抗体分子组成的；2）高度特异性：单抗是针对一个抗原决定簇的；3）无限量供应性：分泌特异单抗的杂交瘤细胞系一旦建立，即可在液氮中长期保存，并可根据需要随时生产理化特性和免疫生物学特性明确的单抗试剂。同一种单抗
3、不同批次的差异很小，便于标准化。（2）单抗的交叉反应特异性强是单抗的特性，但有时单抗可与相关或不相关的抗原发生交叉反应。因为单抗所识别的是抗原分子上的单个抗原决定簇，其他相关或不相关的抗原分子上有相同或相似的抗原决定簇就可发生交叉反应。如有些鸡马立克氏病病毒单抗可以与伪狂犬病病毒发生交叉反应。筛选没有交叉反应的单抗，如在制备新城疫病毒单抗时，首先要去掉与其他副粘病毒发生交叉反应的单抗。因为新城疫病毒有些抗原决定簇是与其他副粘病毒共有的。利用交叉反应的特性，如筛选沙门氏菌的属特异单抗。3、荧光抗体法（fluorescene Ab） 、化学发光免疫检测技术（immunity detection）
4、、DNA 探针（probe ）和聚合酶链式反应（PCR ）等先进分子生物学检测技术的建立，大提高了诊断方法的敏感性和特异性，促进了诊断试剂的发展。四、新型生物反应器（Bioreactor）和新分离技术（New isolation ）不断出现各种反应器的应用原则一般是：1）进行悬浮培养，可用气升式、搅拌式、中空纤维管及陶质矩式通道蜂窝状生物反应器；2）进行贴壁培养，可用搅拌式（微载体系统） 、中空纤维管及陶质矩式通道蜂窝状生物反应器；3）进行包埋培养，可用流化床、固定床生物反应器。针对各种生物反应器，还开发出了相应的控制装置和技术。第三章 生物制品的制备原料的选择原则：有效成分含量高，新鲜；原料
5、来源丰富，产地较近；原料中杂质含量少；原料成本低等。原料的选择注意事项：植物原料生长的季节性；微生物原料的对数期；动物原料的年龄与性别。原料的预处理与保存： 动物原料：采集后要立即处理，去除结缔组织、脂肪组织等，并迅速冷冻贮存。植物原料：要择时采集并就地去除不用的部分，保鲜处理；微生物原料：要及时将菌细胞与培养液分开，进行保鲜处理。 原料的保存方法主要有：冷冻法有机溶剂脱水法防腐剂保鲜常用的破碎方法： 磨切法压力法反复冻融法超声波振荡破碎法自溶法或酶解法提取注意事项：选择提取试剂。考虑提取溶剂的用量及提取次数、提取时间。注意提取的温度、pH、变性剂等因素。 分离纯化技术应满足的要求： 技术条件
6、要温和，能保持目的产物的生物活性； 选择性要好，能从复杂的混合物中有效地将目的产物分离出来，达到较高纯化倍数； 收率要高； 两个技术之间要能直接衔接，不需要对物料加以处理或调整； 分离纯化过程要快，能够满足高生产率的需求。 分离纯化主要依赖色谱分离方法。色谱技术是下游精制阶段的常用手段，该法优点是具有多种多样的分离机制，设备简单，便于自动化控制和分离过程中无发热等有害效应。蛋白质类制品的分离纯化方法： (1)沉淀法：原理是使蛋白质胶体颗粒破坏，从而沉淀蛋白质。常用的有盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、与靶物质结合沉淀法（如抗体抗原）等。 (2)按分子大小分离的方法：有超滤法和透折法（即膜分
7、离方法） 、凝胶层析法、超速离心法等。其中膜分离法可用于生物大分子物质的浓缩、分级和脱盐。 (3)按分子所带电荷进行分离的方法：离子交换柱层析法、电泳法、等电聚焦法等。(4)亲和层析法核酸类药物生产方法：主要有提取法和发酵法。糖类制品的分离纯化方法：（1）提取方法：非降解法适用于从含一种粘多糖的动物组织中提取粘多糖，提取采用的溶剂是水或盐溶液。降解法（degradation）适用于从组织中提取结合比较牢固的粘多糖。（2）分离方法：沉淀法和离子交换层析法。脂类制品的分离纯化方法：沉淀法、吸附层析法、离子交换层析法 洗脱一般是采用极性逐渐增大的洗脱液来进行，非极性的先流出，极性的后流出。 氨基酸类
8、制品的分离纯化方法 氨基酸的生产方法：蛋白质水解法（酸水解、碱水解和酶水解） 、发酵法用盐酸水解为常用方法，其优点是水解迅速、完全，产物全部是 L型氨基酸，缺点是色氨酸全部被破坏，丝氨酸等部分被破坏。碱水解法易产生消旋作用，较少应用。酶水解法水解不够完全。 氨基酸的分离方法：有沉淀法、吸附法和离子交换法人血浆白蛋白制剂的制备白蛋白又称清蛋白，白蛋白是血浆蛋白中含量最高（3.84.8%） 、分子量最小、分子数最多的一类蛋白质。从人体中分离的白蛋白有两种：一种是从健康人血浆中分离制得的人血清白蛋白，另一种是从健康产妇胎盘中分离制得的胎盘白蛋白。白蛋白工艺要点：络合：对于络合所要求的 pH 值，可以
9、略高些，这样，白蛋白络合完全，络合物形成一个相当硬的块，倾倒上清液方便，损失少。但不能太高，以防络合血浆中的其它蛋白，影响解离与白蛋白制剂的纯度。若 pH 值偏低，络合不完全，络合物松软，甚至成汤状，不利于倾去上清液。血浆搅拌用 NaHCO3 调节 pH 至 8.5-8.7 之间，缓慢加入与血浆等体积的 2.3%利凡诺溶液，边加边搅拌，充分络合后，静置 24h，分离上清与络合物沉淀。加入 2.3%利凡诺溶液比加入 5%利凡诺溶液的效果好？因为加 5%利凡诺溶液常造成灭活时白蛋白部分变性或者分装困难。加入 2.3%利凡诺溶液的体积一般不超过血浆体积的一半。这可能是加入利凡诺溶液除去了解离物中过多
10、的 Cl-而澄清，或者是加入的利凡诺（过量）使白蛋白与利凡诺的络合物反溶，从而使造成混浊的物质消失，达到澄清的目的。解离：生产中要严格控制溶液的温度。25左右室温，络合物形成一个硬块，利于去上清和解离。温度太低，虽然不影响络合，但络合物呈稀糊状，倾倒上清液时常会丢失部分络合物，而且络合物内残存较多的利凡诺的水溶液。解离温度要维持在 40左右，是解离反应的最适温度。解离液的 pH 值在 1.281.45 之间，解离效果良好。络合物中加入解离液并搅拌均匀后，将解离后混合溶液 pH 值控制在 6.0 左右较理想。以解离后解离混合溶液 pH 值决定加入解离液的体积。解离后解离混合液的 pH 值高于 6
11、.5 时，表明加入的解离液少了，有部分络合物未被解离开；低于 5.85，表明加入的解离液多了，解离过度。这两种情况下，解离效果均不佳。在沉淀中加约二分之一血浆体积的灭菌蒸馏水解离所得到的络合物沉淀，将解离混合物溶液用 0.5mol/L HCl 调节 pH 至 5.5-6.0，加 NaCl 至 0.15%0.2%，充分搅拌、40过夜解离（8-10h） 。在生产过程中常发现，由于解离效果差，从而不能使生产过程顺利进行。方法：（1）加入活性炭法：在解离效果略差，即能够较顺利地离心，得到部分或全部稍混浊的滤液，但不能正常进行压滤时，加入适当的活性炭于滤液中，搅拦均匀后，立即离心，由于活性炭吸附溶液中粘
12、稠物质，形成大颗粒，经离心可以除去杂质，起到澄清的作用。（2）加入利凡诺法：在解离时，在由加入的盐酸或（和）盐过多而造成解离物的滤液混浊的情况下，变性前后，向解离物中加入适量的利凡诺溶液均会起到澄清的作用，而回收率却不会降低太多。变性前加利凡诺溶液比变性后加利凡诺溶液的效果显著。由于前者在变性过程中反应温度升高了，反应时间增加了。（3）多次络合法：如果解离效果极差，用以上两种方法处理都难以达到澄清的目的，那只有采取多次络合法，即在尽量除去解离物中粘稠物质后，将其 pH 值调至 9.09.2，加入适量的 5%利凡诺溶液，进行重络合，继尔重解离，一般都会得到很理想结果。如果仍然出现解离不良的现象，
13、重复以上处理过程，直到得到满意的结果。这种方法使产品纯度高，外观变黄（棕） ，同时也使成本提高，回收率降低。去杂蛋白：白蛋白具有生物活性，凡是使蛋白质变性的温度都会使白蛋白变性。65条件下变性 1h，离心分离出上清液。热处理：在 600.5条件下处理 10h，灭活病毒。 检验方法：冻干品白色疏松物体。白蛋白含量占 95%以上，水分15000 IU/mg 蛋白质。 绒膜促性激素（HCG）工艺要点：吸附粗品：HCl 调孕妇尿至 pH4-5，加苯甲酸乙醇饱和液（孕妇尿：苯甲酸乙醇饱和液：乙醇 = 1:0.075:5）搅拌 1h 静置 2-3h，过滤，弃滤液，得吸附物。在搅拌下加入 95%乙醇，至苯甲
14、酸全部溶解有絮状沉淀产生，静置过夜，离心，沉淀用 95%乙醇和丙酮洗涤，干燥得粗制品。 提取：加 10 倍量的 41/15 mol/L、pH4.8 醋酸盐缓冲液，搅拌 4h，离心，取上清液。沉淀再提取 2h。合并两次提取液，弃去沉淀。离子交换层析：CM-Sepharose 柱用 0.01mol/L 的醋酸盐缓冲液平衡后样品上柱。依次用pH4.8、0.01mol/L 的醋酸盐缓冲液和 pH5.9、0.01mol/L 的磷酸盐缓冲液洗涤出两个峰（杂质）。再用 pH8.5、0.2mol/L 的醋酸盐缓冲液洗脱，得到的第 3 峰即为 HCG。羟基磷灰石柱层析：柱用 pH6.8、0.5mmol/L 磷酸
15、盐缓冲液平衡。样品用pH6.8、0.5mmol/L 的磷酸盐缓冲液进行层析上柱。洗脱先用 pH6.8、0.5mmol/L 再用 pH6.8 1.0mmol/L 的磷酸盐缓冲液。得到 I、II 活性峰。然后冷冻干燥。HCG 纯品的比活性为10,000-12,000IU/mg 蛋白质。白细胞介素-2（IL-2）工艺要点 ：诱生：刺激人外周血白细胞，37培养。病毒灭活和固液分离：HCl 调节 pH 再用 NaOH 调,除去变性杂蛋白。分级沉淀：加饱和硫酸铵溶液至 0.35 饱和度，4静置 24h，离心，收集沉淀。除盐：除沉淀溶于 pH6.5、 10mmol/L 的磷酸钠缓冲液（ PBS）中（内含 2
16、%（g/100mL）正丁醇,0.15mol/L NaCl） 。用 pH6.5 的 10mmol/L PBS 透析 24h（更换 5 次透析外液） 。 蓝色琼脂糖层析：透析内液通过 Sepharose 4B 层析柱，用 200mL 平衡柱缓冲液洗去不吸附蛋白，再用含 0.4mol/L NaCl 的 PBS 液洗涤亲和柱，最后用含 1.0mol/L NaCl 的 PBS 液解吸IL-2 活性组分。凝胶层析：活性组分经超滤浓缩，上 Ultrogel ACA44 层析柱，柱用含 0.1%聚乙二醇MW6000 的 2%正丁醇和 pH7.6 的 0.5mol/L 甘氨酸的 0.2mol/L Tris-HCl 洗脱，得 IL-2。 动物来源生物制品的制备胰岛素的工艺要点提取：绞碎胰脏，加 2.3-2.6 倍的 86%-88%乙醇和 5%的草酸，提取 3h。浓缩：30减压浓缩至比重为 1
