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1、远志汤有效成分对 APP/PS1 小鼠氧化损伤的保护作用机制研究 董海影 丛欢 王俊苹 弓箭 柏青杨 齐齐哈尔医学院病理学院 摘 要： 目的 通过观察远志汤有效成分即 -细辛醚+远志皂苷 (TEN) 对 APP/PS1 双转基因小鼠磷脂酰肌醇 3-激酶 (PI3K) /蛋白激酶 B (Akt) /糖原合成激酶 3 (GSK-3) 信号通路的调控, 探讨远志汤防治阿尔茨海默病 (AD) 的作用机制。方法 将 3 月龄 APP/PS1 双转基因小鼠分为模型组、盐酸多奈哌齐组 (0.33 mg/kgd) 、-细辛醚+TEN 低、中和高剂量组18.5、37.0 和 74.0 mg/ (kgd) , 选
2、同月龄 C57BL/6 小鼠为空白对照组, 采用 Morris 水迷宫法和新物体识别实验检测小鼠的学习记忆能力, 采用分光光度法检测超氧化物歧化酶 (SOD) 、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-PX) 、过氧化氢酶 (CAT) 活性, 以及丙二醛 (MDA) 含量。采用 Western blot 检测 GSK-3、Akt, 以及两者磷酸化蛋白表达。结果 -细辛醚协同 TEN 可增强 APP/PS1 双转基因小鼠的学习记忆功能, 同时还能升高 SOD、CAT 和 GSH-PX 的活性, 降低 MDA 含量, 诱导 Akt 的蛋白表达, 抑制 GSK-3 的表达。结论 远志汤有效成分即 -细辛醚+T
3、EN 可通过调控PI3K/Akt/GSK-3 信号通路, 对 APP/PS1 双转基因小鼠氧化应激损伤发挥保护作用。关键词： -细辛醚; 远志皂苷; APP/PS1 双转基因小鼠; PI3K/Akt/GSK-3 信号通路; 作者简介：柏青杨, E-mail:收稿日期：2017-02-11基金：国家自然科学基金青年项目 (No:81403131) Study on protective effect of effective components of Polygala Decoction on oxidative damage in APP/PS1 double transgenic mice
4、Hai-ying Dong Huan Cong Jun-ping Wang Jian Gong Qing-yang Bai Pathological Diagnosis Center, Qiqihar Medical University; Abstract： Objective To observe the regulative effect of -asarone and Tenuigenin on the PI3 K/Akt/GSK-3 signaling pathway in APP/PS1 double transgenic mice, to explore the mechanis
5、m of Polygala Decoction in prevention and treatment of Alzheimers disease. Methods Three-month-old APP/PS1 double transgenic mice were divided into model group, Donepezil hydrochloride group (0.33 mg/kgd) , high-dose -asarone and Tenuigenin group, medium-does -asarone and Tenuigenin group and low-do
6、se -asarone and Tenuigenin group (18.5, 37.0 and 74.0 mg/kgd) . C57 BL/6 mice of the same age were selected as the control group. Morris water maze test and new object recongnition task were used to measure the spatial learning and memory ability. Spectrophotometer was used to detect the activity of
7、 SOD, catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GSH-PX) and the content of MDA. Western blot was performed to evaluate the expressions of glycogen synthase kinase-3 (GSK-3) , p-GSK-3, Akt and p-Akt. Results -asarone and Tenuigenin significantly ameliorated the cognitive defect of APP/PS1 double tra
8、nsgenic mice, increased the activity of SOD, CAT and GSH-PX, while decreased the content of MDA, suppressed the activation of GSK-3 and enhanced the activation of Akt. Conclusions -asarone and Tenuigenin can inhibit the oxidative stress of brain tissue, and exhibit positive therapeutic effect on Alz
9、heimers disease by regulating the activity of the PI3 K/Akt/GSK-3 signaling pathway.Keyword： -asarone; Tenuigenin; APP/PS1 double transgenic mouse; PI3K/Akt/GSK-3 signaling pathway; Received： 2017-02-11阿尔茨海默病 (Alzheimer disease, AD) 是由多方、多种和多层次因子共同引发而成, 其中“自由基损伤”这一因素在 AD 发病机制的关键环节中起着至关重要的作用, 在 AD 疾病
10、发生的早期即已出现氧化应激, 先于老年斑形成, 以及神经元纤维缠结的出现1-2。AD 的致病因素错综复杂, 是多种神经递质和病理代谢产物相互协同促发而成, 导致其靶向治疗药物开发困难。目前经由美国FDA 批准, 临床上广泛使用的, 治疗 AD 的药物仅有几个, 但几乎均为胆碱酯酶抑制剂, 其远期疗效并不理想, 也使临床治疗存在诸多困难3。因此, 研究我国具有知识产权的抗 AD 创新药物和新方法是当前一项十分紧迫的研究任务。临床上运用中医的“整体观念”与“辨证论治”防治 AD, 有效地缓解了疾病的进程, 改善了患者的生活状态, 有效地减轻了家庭和社会的负担4。中药复方多方位、多靶点和整体调控的优
11、势, 与 AD 多种致病因素互为因果的特点相互契合。其中石菖蒲-远志药是治疗 AD 方剂的基本结构, 用药频率为 34%5。本论文就是在上述研究基础上, 依托选自政和圣济总录的远志汤 (由远志和石菖蒲按照 11 配伍而成) , 观察石菖蒲的有效成分 -细辛醚 (-asarone) 与远志的有效成分远志皂苷 (Tenuigenin, TEN) 协同作用于APP/PS1 双转基因小鼠, 分析 -细辛醚+TEN 对 APP/PS1 双转基因小鼠磷脂酰肌醇 3-激酶 (Phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K) /蛋白激酶 B (proteinkinase B, AKt)
12、 /糖原合成激酶 3 (Glycogen synthase kinase 3, GSK-3) 通路的影响, 从而进一步探讨远志汤对氧化应激损伤的保护作用和治疗 AD 的作用机制。1 材料与方法1.1 药物与试剂-细辛醚由天津一方科技有限公司提供 (CAS:00011017-T9K) , TEN 由南京景竹生物科技有限公司提供 (CAS:JZ20160327A) , 经 HPLC 测定, 纯度均98%, 盐酸多奈哌齐 (donepezil hydrochloride tablets, DHT) 由卫材 (中国) 药业有限公司提供 (CAS:C14200012042) , 超氧化物歧化酶 (sup
13、eroxide dismutase, SOD) 、丙二醛 (malondialdehyde, MDA) 、过氧化氢酶 (Catalase, CAT) 和谷胱甘肽过氧化物酶 (glutathione peroxidase, GSH-PX) 均由南京建成生物工程研究提供 (CAS:20150422、20150423、20150423 和20150417) , Akt 和 GSK-3 一抗均由美国 Cell Signaling Technology 公司提供 (CAS:9315S、27C10) 。1.2 动物APP/PS1 双转基因小鼠 (南京生物医药研究院, 编号 D000268) , 3 月龄,
14、 50 只, 雄性;C 57BL/6J 小鼠, 3 月龄, 10 只, 雄性。饲养于齐齐哈尔医学院实验动物中心 SPF 级饲养室。1.3 分组和给药将 3 月龄 APP/PS1 双转基因小鼠分为模型组、盐酸多奈哌齐组0.33 mg/ (kgd) 和药物低、中和高剂量组18.5、37.0 和 74.0 mg/ (kgd) , 均由-细辛醚和 TEN 按照 11 配制而成, 选同月龄 C57BL/6 小鼠为空白对照组, 空白对照组和模型组给予等体积的生理盐水 (normal saline, NS) 灌胃, 1 次/d, 连续灌胃 90 d。1.4 Morris 水迷宫检测给药结束后进行 Morri
15、s 水迷宫行为测试。水迷宫为一直径 150 cm, 高 60 cm的不锈钢圆形水池, 水池侧壁上配备一长杆, 上悬挂红外摄像头。水迷宫内设置一座底面为 6 cm10 cm, 高为 40 cm 的有机玻璃平台。以水迷宫中心点为原点, 在迷宫的侧壁上标明东、南、西、北 4 个方向的入水点。标明入水点后, 将平台放在迷宫西南象限正中距池壁 22 cm 处, 迷宫内注入水, 水温控制在 (221) , 加入奶粉后, 迷宫中上位水线高于安全平台 1 cm, 训练期环境保持安静与参照物不变。训练期间任选东、南、西、北 4 个方向的入水点, 将小鼠面向迷宫壁放入池中, 训练间隔为 60 s。1.4.1 定位
16、航行实验为期 5 d, 4 次/d, 选择迷宫侧壁的东向为入水点, 摄像头记录小鼠的游泳轨迹图与逃避潜伏期, 即小鼠找到水下平台的时间, 设定逃避潜伏期的时限为 2 min。1.4.2 空间探索实验定位航行实验结束后将水下平台撤除, 在同一入水点将小鼠面向池壁放入水中, 让小鼠在无平台情况下寻找记忆中的平台, 记录在 2 min 内跨过原平台位置的次数。1.4.3 新物体识别实验检测箱为 60 cm40 cm80 cm, 由黑色聚酯塑料材质构成的封闭箱, 箱左右内侧壁镶嵌 LED 灯条, 顶部悬挂摄像头观察动物的活动情况及探索过程。实验检测过程分为适应期、熟悉期和测试期 3 个阶段。 (1) 适应期:为期 3 d, 每天将小鼠依次放入检测箱内, 熟悉环境 10 min; (2) 熟悉期:第 4 天, 将 2 个完全相同的正方体红色积木块放入检测箱内对称的位置处, 两个积木距离箱侧壁与箱后壁的
