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1、T 细胞受体基因转导 T 细胞免疫治疗技术的研究进展 李伟 施炜星 杜盈 王倩 杨春霞 泰州医药高新技术产业园区 江苏西迪尔生物技术有限公司 上海宇研生物技术有限公司 摘 要： T 细胞受体 (T cell receptor, TCR) 基因转导的 T 细胞疗法 (TCR-T) 是目前发展较快的一种新的过继性细胞免疫疗法, 该方法主要是将肿瘤特异的 TCR 基因通过各种载体转入自体或异体的淋巴细胞中, 再回输至患者体内以达到杀伤肿瘤细胞的目的。因此, 肿瘤特异的高亲和性的 TCR 基因的获取是提高 TCR-T细胞治疗的一个重要因素, TCR 基因的高水平表达和 TCR 双链的正确配对也是确保
2、TCR 能够在 T 细胞表面发挥正常抗原识别功能的必要条件。现对 TCR 的表达及调控机制、TCR 基因转导和亲和力的优化策略, 以及 TCR-T 在肿瘤治疗临床试验中的进展与所面临的问题做了详细的阐述。关键词： T 细胞受体; 过继性细胞治疗; TCR-T 脱靶效应; 临床试验; 作者简介：杨春霞 E-mail:收稿日期：2017-06-13基金：上海市科学技术委员会产学研项目 (16DZ19-11000) Research advances in T cell receptor gene transfected T cell immunotherapyLI Wei SHI Wei-Xing
3、 DU Ying WANG Qian YANG Chun-Xia Taizhou Medical Hi-Tech Zone; Jiangsu CTL Biological Technology Co., Ltd; Shanghai Cell-Research Biological Technology Co., Ltd; Abstract： T cell receptor (TCR) gene transfected T cell therapy (TCR-T) provides autologous or allogeneic T cells that are genetically eng
4、ineered with tumor specific TCR chain and constitutes a promising approach of adoptive cellular immunotherapy for the treatment of tumors. The current challenge of TCR gene therapy is the acquisition of tumor-specific high-affinity TCR gene and the optimization of TCR and transgene pairing to enhanc
5、e the functional avidity of therapeutic T cells. Here, we review the expression and regulation mechanism of TCR gene, the optimization strategies of TCR gene transduction and affinity, as well as the clinical value of TCR-T therapy in the treatment of cancer.Keyword： T cell receptor; adoptive cell i
6、mmunotherapy; on-target/off-tumor toxicity; clinical trials; Received： 2017-06-13过继性细胞治疗 (adoptive cell therapy, ACT) 是目前快速发展的肿瘤细胞免疫治疗方法1-2。早期过继性细胞免疫治疗主要是把自体或异体肿瘤反应性T 细胞回输到患者体内, 使患者肿瘤消退, 这种方法在白血病和黑色素瘤中已经取得了一定的成功。自然发生的肿瘤浸润性淋巴细胞 (tumor infiltrating lymphocytes, TIL) 已被证明对转移性黑色素瘤患者有 49%72%的客观应答率3。在黑色素瘤
7、患者中, 使用克隆的细胞毒性 T 淋巴细胞 (cytotoxic lymphocytes, CTL) 也显示出介导肿瘤消除的效果, 但是应答率低于 10%4。虽然 TIL 疗法表现出一定的效果, 但到目前为止, 仍没有被广泛应用, 原因在于 TIL 疗法有较多限制:首先, 有抗肿瘤活性的 TIL 必须是肿瘤产生的, 且要有足够的数量;其次, TIL 的一个最大限制在于这种疗法不能使机体自主产生有抗肿瘤活性的 T 细胞5。最近使用的嵌合抗原受体 (chimeric antigen receptors, CAR) T 细胞技术 (CAR-T) 以及 TCR-T 作为免疫治疗的最新和最有效的技术,
8、受到广泛的关注和研究。CAR-T 技术是将细胞外能识别某种肿瘤抗原的单链抗体的可变区 (VH+VL) (亦称为 single chain fragment variable, sc Fv) 与跨膜区 (一般是引入多个共刺激信号分子, 如 CD28、CD134 和 CD137 等) , 以及细胞内 T 细胞的信号分子 CD3- 链通过基因重组在体外偶联为一个编码 CAR 的基因, 然后将 CAR 基因转染患者的 T 细胞, 使 CAR-T 细胞在体外能大量增殖, 回输到患者体内后也能存活相当一段时间, 并靶向性地杀伤肿瘤细胞。CAR-T 治疗复发或难治性血液系统恶性肿瘤已经取得了惊人的结果, 但
9、是由于实体瘤的异质性以及免疫微环境的抑制作用, CAR-T 用于实体瘤治疗还有待进一步研究6。与 CAR-T 技术相比, TCR-T 在实体瘤, 如晚期滑膜肉瘤和恶性黑色素瘤的治疗上效果突出7。TCR-T 与 CAR-T 技术的不同之处在于, TCR-T 只是将 TCR 基因从有肿瘤活性的 T 细胞中克隆出来, 然后再转到正常 T 细胞里去。因此, TCR-T是通过 TCR 复合物的信号, 即主要组织相容性复合体 (major histocompatibility complex, MHC) 与肿瘤抗原肽的复合物, 激活重新编程的T 细胞, 相对于 CAR-T 独立识别抗原来说, TCR-T
10、存在 MHC 限制, 但是 TCR 基因大多来自于 TILs, 因此, TCR-T 对抗免疫抑制性肿瘤微环境有一定效果, 能够用于实体瘤免疫治疗。随着高通量测序技术的发展, 单细胞克隆的 TCR 基因的鉴定工作也较之前更加简单8。因此, 以 TCR 为基础的免疫疗法显示出了无可取代的优越性。本文将重点介绍 TCR 基因转导 T 细胞在 TCR 肿瘤抗原的选择、TCR 基因表达和配对、TCR 亲和力以及 TCR-T 临床试验方面的研究进展。1 TCR 细胞治疗的抗原选择TCR-T 细胞治疗的第一步是选择适当的肿瘤抗原靶向 T 细胞。一般肿瘤抗原分为两类:第一类是病毒来源的或仅在肿瘤组织上表达的肿
11、瘤特异性抗原 (tumor specific antigen, TSA) , 大多数 TSA 是由基因的随机突变引起的, 不同的患者之间具有较大差异性;第二类是肿瘤相关抗原 (tumor-associated antigen, TAA) , 许多人类 TAA 是非突变的自身抗原, 在不同个体间共同表达, 并且在肿瘤细胞中过度表达。目前, 几乎所有临床试验中的 TCR-T 细胞治疗选择的靶点都是针对 TAA 的, 如 gp100、MART-1、Tyrosinase9-10等。除了 TAA, 许多研究者也把精力集中在癌睾抗原 (cancer-testis antigen, CTA) 上, CTA
12、是一种免疫原性蛋白, 通常在非 MHC 表达的睾丸生殖细胞中正常表达, 在许多肿瘤细胞中异常表达。CTA 基因大多定位在人类 X 染色体上, 第一个 CTAMAGE-A1 是在黑色素瘤患者体内发现的。现在许多 CTA 基因已被确定在多种肿瘤中表达, 如黑色素瘤、膀胱癌、肺癌和肝癌等。随着研究的深入, 发现有些 CTA 并不严格限制于正常睾丸中表达, 在一些正常组织中也有表达。现已发现胎儿时期的卵巢能表达多种 CTA, 成人的卵巢也有少量表达。除了MAGE 家族基因, NY-ESO-1 也在各种肿瘤中广泛表达, 以 NY-ESO-1 为靶点的TCR-T 疗法也取得了较好的初步效果11。靶向 CT
13、A 的优点在于 T 细胞会选择性地消除肿瘤细胞, 并避免或减少对正常组织的毒性。除此之外, 突变抗原也成为 TCR-T 靶标选择的新热点, 突变抗原由于其在肿瘤细胞中特异性突变的特点, 使得 TCR-T 细胞治疗不会靶向正常细胞或组织, 增加了其安全性并减小了脱靶效应的风险。Inderberg 等12用转化生长因子 受体 II 的移码突变 (TGFRII) 产生的新型多肽筛选出阳性 CTL 克隆并鉴定其TCR 序列, 该突变存在于 15%的散发性结直肠癌患者中, 由该 TCR 基因转导的 T细胞具有明显抑制结肠癌细胞生长, 增加 NOD/SCID 荷瘤小鼠生存率的特点。2 TCR 的表达成熟
14、T 细胞表面表达 1 万4 万个 TCR 分子, 表达水平与抗原反应性直接相关。TCR 是由两条多肽链组成的异源二聚体, 链 (约 95%T 细胞表达) 或 链 (约 5%T 细胞表达) , 其结构与免疫球蛋白类似, 每条链均由可变区和恒定区组成, 通过二硫键连接。每条链的可变区有 3 个互补决定区 (complementary determining region, CDR) , CDR 可识别各类抗原, 与 MHC-多肽分子形成复合物。它们的胞内区需要与 T 细胞内的 CD3 分子形成复合物才能发挥其信号传递功能, 其中 链恒定区 (Cdomain) 在 TCR 与细胞内 CD3 分子信号
15、传递的过程中起重要作用13。当 TCR 与 CD3 复合物的组分 CD3 完全组装时, TCR 分子能在细胞表面表达。不完全的组装会导致蛋白质保留在细胞内并最终在内质网中降解。因此, 当将外源性 TCR 引入成熟 T 细胞时, 其将与内源性 TCR 竞争 CD3 分子, 可能会阻碍外源 TCR 的表达14。2.1 表达系统的选择TCR 转染的研究大多采用 逆转录病毒载体系统或者是慢病毒载体系统15。除了极少数几例在治疗免疫缺陷病时用基因转染造血干细胞时出现了插入突变以外, 在过去的 20 年里, 几乎没有与 -逆转录病毒载体基因转移系统相关的安全问题的报告。虽然 -逆转录病毒载体是临床试验中基
16、因转染的首选系统, 然而, 该系统需要通过 TCR 激活 T 细胞以诱导细胞分裂, 这可能对它们的体内扩增有一定的局限性。作为替代, 慢病毒载体被开发用于 TCR-T 的肿瘤免疫治疗。慢病毒系统具有在 TCR 活性缺失时转染 T 细胞的优势, 可以不需要提前的刺激而促进完全静止 T 细胞的转化, 因此, 对维持转染的细胞在低分化状态, 对过继性免疫细胞疗法是有一定好处的。不同于 逆转录病毒载体优先整合在基因转录起始位点, 慢病毒载体由于其随机整合的方式, 不容易产生插入突变。转座子是一个相对较新, 更容易操作并且需要较少前期安全测试的基因转移系统, 如 Sleeping Beauty Piggy Bac16-17。与逆转录病毒不同, 转座子能够完全转化非活化的静止细胞, 并且不优先整合入启动子区域, 这可能使其在插入转化方面更加安全。使用这些方法, 经基因工程修饰的 T 细胞能够在短期扩增, 并显示出抗
