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1、高效液相色谱法测定兔血浆中注射用纳米羟基喜树碱的浓度 陈渝军 1, 易以木 2(1.武汉市妇女儿童医疗保健中心，湖北武汉 430016；2.华中科技大学同济医学院药学院，湖北武汉 430030) 摘要目的：建立家兔血浆中注射用纳米羟基喜树碱含量的 HPLC 测定方法。方法：血浆样品酸化后，提取分析。色谱柱 C18 （10 m， 250 mm4.6 mm ID） ，流动相为 10 mmol/L 磷酸盐缓冲溶液（pH4.0）-甲醇（50：50） ，流速 1.0 mL/min，柱温 30 ，检测波长 384 nm。以 5.0 mg/kg剂量给大白兔耳缘静脉推注纳米羟基喜树碱针，于不同 时间点采血 测
2、定药物浓度。结果：羟基喜树碱保留时间为 8.7 min，定量线形范围为 20-8000 ng/mL。血浆中羟基喜树碱的回收率为 96.92%-103.51%，日内精密度 7.87%，日间精密度 11.55%。纳米羟基喜树碱注射后符合三室模型 。结论：本法简便实用，定量准确，可满足纳米羟基喜树碱动力学研究的需要。关键词羟基喜树碱；纳米；高效液相色谱；血药浓度Determination the concentration of injected-nano-hydroxycamptothecin in plasma of rabbits by HPLCCHEN Yu-Jun1, YI Yi-Mu2
3、(1. Wuhan medical and health center for women and children, Hubei Wuhan, 430016; 2.School of pharmacy, Tongji medical college, Huazhong university of science and technology, Hubei Wuhan, 430030)Abstract Objective: To establish a HPLC method for the determination of injected-nano-hydroxycamptothecin
4、in plasma of rabbits. Methods: After acid treatment, plasma samples were injected and measured by abstraction. The Chromatographic column was C18(10 m， 250 mm4.6 mm ID). Methannol-10mmol/L phosphate buffer (pH4.0) (50:50) was served as mobile phase at 1.0 mL/min . Detection wavelength was 384 nm. De
5、termination the concentration of injected-nano-hydroxycamptothecin in plasma of rabbits after iv. administration with the dosage of 5.0 mg/kg. Results: The retention time of hydroxycamptothecin was 8.7 min. A good linearity was shown in the concentration range of 20-8000 ng/mL. The recovery was betw
6、een 96.92% and 103.51%. The intra-day RSD was less than 7.87% and the inter-day RSD was less than 11.55%. The concentration-time curves of injected-nano-hydroxycamptothecin mainline conformed to three-compartment model. Conclusion: This method was simple, practical and accurate. It could be applied
7、in pharmacokinetic study of nano-hydroxycamptothecin.Key words hydroxycamptothecin; nano; HPLC; drug concentration in plasma喜树碱(camptothecin,CPT)是从我国特有的珙垌科植物喜树的树千、树皮和果实中提取的一种具有抗肿瘤作用的生物碱，但由于毒性大而限制其临床应用。10-羟基喜树碱(10-hydroxycamptothecin,HCPT)是喜树碱的半合成衍生物，体外和动物实验显示它比 CPT的抗肿瘤作用强和抗瘤谱宽且毒性较低。纳米技术的出现，使保留内酯结构的
8、HCPT 进入体内成为可能，为充分发挥其抗肿瘤活性带来希望。本研究将从 HCPT 纳米针静脉注射后在家兔血浆药物浓度随时间变化规律方面考察 HCPT 纳米针的药动学特性，评价其临床应用前景。1 仪器、试药与实验动物 11 仪器 Lab Alliance 高效液相色谱仪（包括 Lab Alliance PC3000HPLCSystem 和 Model 500型 UV 检测器） ，色谱柱为 Irregular-HC18柱（10 m，4.6 mm250 mm，天津市色谱科技有限公司提供） ，Heraeus 高速离心机（德国） ，LDZ5-2 型低速离心机（北京医用离心机厂） ，BRANSON 351
9、0 型超声振荡仪（美国） 。12 药品、试剂与实验动物 HCPT 内酯标准品（批号：20020501，含量：98.6% ）和HCPT 注射用纳米针（批号：20030501，含量：97.0% ）由武汉李时珍药业有限公司提供。甲醇和乙腈为色谱纯（天津市运盛化学试剂科技有限公司） ，磷酸和其它试剂均为分析纯（天津化学试剂三厂） 。日本大耳兔，天津市动物中心提供（实验动物质量合格证号：WJ 津实动质 R-A 准字第 001 号） ，雌雄兼用，体重 2.53.0 kg。2 测定方法及条件 21 色谱条件：色谱柱 C18 （10 m， 250 mm4.6 mm ID） ，流动相为 10 mmol/L 磷酸
10、盐缓冲溶液（pH4.0）-甲醇（ 50：50） ，流速 1.0 mL/min，检测波长 384 nm，柱温 30 。22 血浆样品的采集 ：实验用家兔禁食 12 小时，于给药后按设计的时间点，经耳缘静脉取血 2 mL，置于 5 mL 肝素化试管，3000 r/min 离心 10 min，取血浆，-20 冷冻保存。23 血浆样品的处理：精密量取 0.5 mL 血浆样品于 2 mL 离心管，加 85%磷酸 2 L，室温避光环合 2 小时以上。环合后的样品加乙腈 1 mL，充分混匀，超声振荡 5 min，13000 r/min离心 10 min。取离心后上清液 1.1 mL，置于 10 mL 离心管
11、， 50 水浴，氮气流吹干液体，残渣以 80 L 流动相溶解， 20 L 进样环进样。3 分析方法考察结果 31 方法专属性取家兔空白血浆，除不加标准品溶液外，其余按“血浆样品处理”顶下方法处理并分析，获得空白血浆的色谱图，将一定浓度 HCPT 内酯标准溶掖加入空白血浆中，同法操作，获得相应的色谱图。血浆色谱图中 HCPT 保留时间为 8.7 min，血浆中内源性物质不干扰 HCPT的测定。A B 1 C 1A：空白家兔血浆样品； B：家兔空白血浆+HPCT 标准品；C：HCPT 给药后 30 min 家兔血浆样品；1：羟基喜树碱图 1 HPLC 法检测羟基喜树碱家兔血浆样品色谱图Fig.1
12、HPLC chromatograms of HCPT in rabbit plasma32 标准曲线制备 取兔空白血浆 300 L，加 HCPT 内酯标准品的系列标准溶液 200 L，配制成 HCPT 含量为 20，50，250，1000， 2000， 4000，8000 ng/mL 的血浆样品。按“血浆样本的处理”项下操作，残渣以 80 L 流动相溶解进样。以 HCPT 标准血浆样品浓度为横坐标，色谱图的HCPT 峰面积为纵坐标绘制低浓度标准曲线，取三条标准曲线的平均值（表 1） ，采用加权最小二乘法计算直线回归方程为：Y 0.003354X 10.8895 ，r=0.9990 （n=3）
13、。表 1.标准曲线数据（n=3）Tab.1 Results of HCPT of standard deviation (n=3)峰面积检测值浓度（ng/mL） 1 2 3平均峰面积 SD RSD%20 7846 7313 7098 7419.0 385.1 5.1950 17263 16600 16512 16791.7 410.5 2.44250 85630 81115 79205 81983.3 3299.3 4.021000 305336 258445 227308 263696.3 39278.2 14.892000 622120 618728 617460 619436.0 240
14、.3 0.394000 1241907 1202490 1135799 1193399.0 63636.0 4.498000 2472470 2644773 2151787 2423010.0 250187.0 10.3233 精密度试验按“标准曲线制备”项下方法配制低、中、高 3 个浓度的 HCPT 内酯血浆样品，每个浓度 5 个样本 1 日内连续测定，根据标准曲线，计算样品的测得浓度、SD 和 RSD%；同法配制 3 个浓度的 HCPT 内酯血浆样品，连续测定 5 天，每天连续测定 2 次，根据标准曲线，计算样品的测得浓度、SD 和 RSD%，精密度试验结果见表 2。表 2. 精密度试验结
15、果（n=5）Tab.2 Results of HCPT of standard deviation in a day (n=5)日内精密度加入浓度（ng/mL） 检测浓度（ng/mL）SD RSD%20 28.29 2.23 7.872000 2245.89 122.81 5.478000 9154.41 559.06 6.113.3.2 日间差 按“标准曲线制备”项下方法配制低、中、高 3 个浓度的 HCPT 内酯血浆样品，连续测定 5 天，每天连续测定 2 次，随行标准曲线，计算样品的测得浓度、SD 和 RSD%，求得测定方法的日间差，数据见表 3。试验数据表明，生物样本的分析方法符合有关
16、规范要求。表 3.标准曲线日间差考察（n=5 ）Tab.3 Results of HCPT of standard deviation inter-day (n=5)检测浓度（ng/mL）加入浓度（ng/mL） 1 2 3 4 5平均检测浓度SD RSD%20 30.31 24.61 23.36 26.94 26.22 26.29 2.64 10.062000 2185.36 2528.71 2256.10 2142.50 2307.95 2284.12 150.82 6.608000 9205.20 9206.75 8222.12 7374.06 7234.12 8284.45 952.34 11.5534 回收率试验 按“标准曲线制备”项下方法配制低、中、高 3 个浓度的 HCPT 内酯血浆样品，每
