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1、液相注意事项特别注意 HPLC 使用过后的系统清洗：含有缓冲盐溶液的流动相的清洗方法：1、先用 100%的纯水冲洗，打开排放阀，用 35ml/min 的流量，洗二十分钟左右后停泵。此举主要是针对吸液系统、泵头、进出口单向阀等体积较大的空间的清洗2、再用 95：5 的甲醇/水清洗整个系统，关闭排放阀，用 1ml/min 的流量，洗3060 分钟后停泵。此举主要是用水清洗整个系统中的盐，用 5%的甲醇主要是为了保护色谱柱。3、最后用 100%的甲醇清洗整个系统，用 1ml/min 的流量，洗 2 分钟左右，然后关机。如果流动相中不含盐，则使用上述第三步清洗即可。反相色谱切换正相色谱流程：1、先将色
2、谱柱用相应的溶剂冲洗干净，然后将色谱柱拆下来密封保存。用双通将进样器与检测器连接。2、将贮液瓶内装入 300ml 的二次蒸馏水，将流速渐次提高到 2.0ml/min 冲洗系统 1.5h。注意观察泵压。3、将流速渐次降到 0ml/min，把二次蒸馏水更换为甲醇， ，将流速渐次提高到2.0ml/min 冲洗系统 1h。4、用同样的方法将甲醇更换为异丙醇、四氢呋喃，各冲系统 1h。5、最后将四氢呋喃更换为预先配制好的流动相冲系统 1h，同时将柱塞杆清洗系统内的 10%异丙醇更换为流动相，保持 50-60 滴/min 的速度清洗柱塞杆。再将双通更换为正相色谱柱，待色谱柱平衡好以后就可分析样品了。什么导
3、致反相柱子污染产生？通常，样品中含有一些对分析者来说不感兴趣的东西。盐、脂质、含脂物质、腐质酸、疏水蛋白质和其它一些生物物质是一些可能在使用时与 HPLC 柱发生相互作用的物质。这些物质有比分析者的目标物或少或大的保留值。那些保留值较小的物质如盐类一般来说在空体积时就被冲出色谱柱。这些非目标产物的干扰能被检测器检测到而且能形成色谱峰，气泡，基线上移或者是负峰。如果样品成分在柱子中有很强的保留而且流动相溶液成分不足以把这些物质洗脱下来，多次上样后，这些吸附在柱子表面的物质通常就会积累在柱头。这些行为通常只有通过平行实验才能发现。有着中等保留值的样品能被缓慢洗出而且表现为宽峰，基线扰动，或者基线漂
4、移。有时候这些被吸附的样品成分累积到一定程度足以使他们开始形成新的固定相。分析物能与这些杂质作用形成一定的分离机理。保留时间会波动，拖尾会出现。如果足够的污染产生，柱子的反压能超过泵所能承受的最大压力，使柱子无法工作以及在堵塞处产生空体积。清洗硅胶键合柱子：再生被污染 HPLC 柱子的关键是知道污染物的性质并且能找到适当的溶剂来去除。如果污染是因为重复进样时强保留物质的累积引起的，利用简单的步骤来除去这些污染物往往能恢复其色谱行为。有时候，经过多次操作以后的色谱柱用 90100的溶剂 B（双溶剂反相系统中较强的溶剂）冲洗20 个体积可以清除污染物。例如，柱子中残留的脂质就能用非水溶剂如甲醇、乙
5、晴、四氢 呋喃。如果你使用的是缓冲液系统，不要直接切换到强溶剂，突然转换到高浓度有机溶剂可能会使 HPLC 流动体系中的缓冲液沉淀，这样会导致更大的问题如柱头 堵塞、管道堵塞、泵泄漏、活塞损伤或进样阀转轴失灵。应该先用无缓冲流动相（即把缓冲液换成水） 。冲洗 510 个体积以后才更换强溶剂。 有时候，强溶剂也没法把残留在色谱柱上的污染物洗掉。那么更强的溶剂或者是一系列溶剂就有必要用来清洗柱子了，如果污染物是非生物物质，使用者可以跳过一个或多个另外的有机溶剂去除污染物。溶剂与溶剂之间的组合有很多。到柱子厂家的网页上能找到推荐的溶剂系统。一般来说，所有的清洗方法都有类似的形式。所用的溶剂都是随溶剂
6、强度增加，经常最后一个溶剂是非常疏水的（如醋酸乙酯甚至是烃） ，可以用来溶解非极性物质 如脂质和油类。我们必须保证一系列溶剂中每个溶剂都能与下一个溶剂互混。清洗过程要结束时，必须借助一个中等强度能互混的溶剂而回到原始溶剂系统。例如， 异丙醇是一个非常好的作为中间步骤的溶剂，因为它能与正己烷或二氯甲烷互溶又能与水相溶剂互溶。但是异丙醇粘度非常大，必须确保较低的流速以免使泵压过高。当然，如果使用紫外检测器的话，避免溶剂在紫外区域有吸收，要不然需使用大量的溶剂冲洗才能使基线平稳。对于典型的硅胶键合柱来说如果没有缓冲溶液的话推荐使用以下溶剂系列：100甲醇；100乙晴；75乙晴25异丙醇；100异丙醇
7、；100二氯甲烷100正己烷；用二氯甲烷或正己烷以后，由于溶剂相容性柱子必须用异丙醇冲洗后才能用原来的水相溶剂。每种溶剂至少冲洗 10 个柱体积。如 250mm4.6mmHPLC 分析柱，分析者可以用 12ml/min 的流速来冲洗，要回复原来的溶剂体系，不需要每一步都冲洗，可以跳过中间步骤。中间步骤推荐使用异丙醇，然后用没 有缓冲的流动相，最后回复起始流动相配置。四氢呋喃是另外一种比较受欢迎的去除污染的溶剂。如果使用者怀疑柱子被严重污染，可以二甲基亚砜（DMSO）或 者二甲基甲酰铵和水按 50：50 的比例混合用低于 0.5ml/min 的流速流过色谱柱。成功再生反相柱子是一个非常耗时间的过
8、程，溶剂冲洗可以利用梯度系统过夜操作。 常见液相色谱柱性能比较。最 常 用 的 万 能 柱 填 料 为 C18， 简 称 ODS柱 ， 即 十 八 烷 基 硅 烷 键 合硅 胶 填 料 （ Octadecylsilyl， 简 称 ODS） 。 这 种 填 料 在 反 相 色 谱 中 发 挥 着 极为 重 要 的 作 用 ， 它 可 完 成 高 效 液 相 色 谱 70 80 的 分 析 任 务 。 由 于C18(ODS)是 长 链 烷 基 键 合 相 ， 有 较 高 的 碳 含 量 和 更 好 的 疏 水 性 ， 对 各 种 类型 的 生 物 大 分 子 有 更 强 的 适 应 能 力 ， 因
9、 此 在 生 物 化 学 分 析 工 作 中 应 用 的 最 为广 泛 。 近 年 来 ， 为 适 应 氨 基 酸 、 小 肽 等 生 物 分 子 的 分 析 任 务 ， 又 发 展 了CH、 C3、 C4等 短 链 烷 基 键 合 相 和 大 孔 硅 胶 （ 20 40m） 。 反相色谱是迄今在高效液相色谱中应用最广泛的技术，主要是因为它适用于分析极大多数的非极性物质和很多的可离子化的及离子化合物。大多数用于反相色谱的固定相都是天然的疏水物质，因此，分析物是按照它们与固定相的疏水相互作用的大小来分离的，含有疏水的机制也能以同样的保留方式分离。按 键 合 到 基 质 上 的 官 能 团 可 分
10、 为 ： 反 相 柱 ： 填 料 是 非 极 性 的 ， 官 能 团 为 烷 烃 ， 例 如 ： C18(ODS)、 C8、 C4等 。 正 相 柱 ： 填 料 是 极 性 的 ， 官 能 团 为 CN 氰 基 、 NH2氨 基 等 。 离 子 交 换 键 合 相 ： 阳 离 子 官 能 团 ： SO3H 磺 酸 基 、 COOH 羧 基 等 。 阴 离 子 官 能 团 ： R4N 季 铵 基 、 -氨 基 等 。 ( 由 于 硅 胶 基 质 的 键 合 相 只 能在 pH 2 7.5的 范 围 内 使 用 ， 而 离 子 交 换 色 谱 要 求 有 更 宽 的 pH 范 围 ， 因此 其 基
11、 质 现 在 仍 主 要 使 用 聚 苯 乙 烯 和 二 乙 烯 苯 。 ) 流 动 相 ： 反 相 色 谱 最 常 用 的 流 动 相 及 其 冲 洗 强 度 如 下 ： H2O 甲 醇 乙 腈 乙 醇 丙 醇 异 丙 醇 四 氢 呋 喃 最 常 用 的 流 动 相 组 成 是 ： 甲 醇 -H2O和 乙 腈 -H2O， 由 于 乙 腈 的 剧 毒 性 ， 通 常 优 先 考 虑 甲 醇 -H2O流 动 相 。 反 相 色 谱 中 ， 溶 质 按 其 疏 水 性 大 小 进 行 分 离 ， 极 性 越 大 疏 水 性 越 小 的 溶 质 ，越 不 易 与 非 极 性 的 固 定 相 结 合
12、， 所 以 先 被 洗 脱 下 来 。 流 动 相 的 pH 对 样 品溶 质 的 电 离 状 态 影 响 很 大 ， 进 而 影 响 其 疏 水 性 ， 所 以 在 分 离 肽 类 和 蛋 白 质 等生 物 大 分 子 的 过 程 中 ， 经 常 要 加 入 修 饰 性 的 离 子 对 物 质 ， 最 常 用 的 离 子 对 试剂 是 三 氟 乙 酸 （ TFA） ， 使 用 浓 度 为 0.1 ， 使 流 动 相 的 pH 值 为 2 3， 这样 可 以 有 效 地 抑 制 氨 基 酸 上 羧 基 的 离 介 ， 使 其 疏 水 性 增 加 ， 延 长 洗 脱 时 间 ，提 高 分 辨 率
13、 和 分 离 效 果 。 完 全 离 子 化 的 溶 质 ， 例 如 强 酸 或 强 碱 ， 其 在 反 相 键合 相 上 的 保 留 值 很 低 ， 近 于 死 时 间 流 出 ， 不 能 进 行 分 析 。 根 据 离 子 对 色 谱 的原 理 将 一 种 与 样 品 离 子 电 荷 （ A ） 相 反 的 离 子 （ B ） ， 称 为 对 离 子 ， 加入 到 流 动 相 中 ， 使 其 与 样 品 离 子 结 合 生 成 弱 极 性 的 离 子 对 ， 即 中 性 缔 合 物 ，从 而 增 强 了 样 品 的 疏 水 性 ， 加 大 了 保 留 值 ， 改 善 了 分 离 效 果 。
14、 正 相 色 谱 常 用 的 流 动 相 及 其 冲 洗 强 度 的 顺 序 是 ： 正 己 烷 乙 醚 乙 酸 乙 酯 异 丙 醇 其 中 最 常 用 的 是 正 已 烷 ， 虽 然 其 价 格 较 贵 ， 但 80 的 顺 、 反 和 邻位 、 对 位 异 构 体 仍 然 要 用 正 相 色 谱 来 进 行 分 离 。 流 动 相 的 选 择 原 则 是 ： 样 品 易 溶 ， 且 溶 解 度 尽 可 能 大 。 化 学 性 质 稳 定 ， 不 损 坏 柱 子 。 不 妨 碍检 测 器 检 测 ， 紫 外 波 长 处 无 吸 收 。 粘 度 低 ， 流 动 性 好 。 易 于 从 其 中 回收 样 品 。 无 毒 或 低 毒 ， 易 于 操 作 。 易 于 制 成 高 纯 度 ， 即 色 谱 纯 。 废液 易 处 理 ， 不 污 染 环 境 。
