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1、本科学生综合性实验报告学号 104120300 姓名 杨从举 学院 生命科学学院 专业、班级 10 应用生物教育 B 班 实验课程名称 发酵工程学实验 教师及职称 唐湘华 （实验师） 开课学期 2012 至 2013 学年 下 学期云南师范大学教务处编印一、实验设计方案实验序号： 1、2 实验名称：根霉曲的制备及糖化能力的测定 实验时间：2013 年 3 月 20 日、3 月 27 日 实验室：学院 1231、实验目的: 掌握固体发酵的基本操作步骤；了解根霉曲制作工艺和基本原理；了解糖化酶的测定方法；对糖化酶的糖化产物及糖化 DE 的计算；了解根霉曲在发酵生产过程中主要应用依据。2、实验原理固
2、体发酵的一般流程保藏菌种 原料 斜面活化 预处理固体三角瓶培养 蒸料固体浅盘培养 冷却 接接种种培养通过固体发酵，根霉在麦麸培养基中进行大量繁殖，产生淀粉酶和糖化酶复合酶系；通过淀粉酶的液化和糖化酶的糖化作用将淀粉转化为还原单糖。淀粉是由葡萄糖通过 -1,4 糖苷键构成的直、链淀粉和 -1,6 位有分支的支链淀粉组成的，直链淀粉约含 100-6000 个葡萄糖单位，支链淀粉平均含 6000 个以上的葡萄糖单位，最高可达 300 万。淀粉酶首先酶解淀粉为小分子的糊精、寡糖和少量单糖；通过糖化酶的作用将小分子的糊精和寡糖降低为还原性的单糖。3、实验器材、材料1器材 天平、烧杯、三角瓶、灭菌锅、超净
3、工作台、培养箱水浴锅、离心机、722 分光光度计、移液枪等。2材料麦麸、 根霉 AS3.866、自来水柠檬酸缓冲液、DNS、1%淀粉。4、实验步骤根霉曲的制备：（1） 、培养基的配制与灭菌（约 60%含水量）麦麸 20g20ml 水 /人 放入烧杯拌匀（以组为单位） 分装于三角瓶包上纱布（至少 6 层）包牛皮纸（一层）包 扎120灭菌 1h 摇动打散瓶内培养基冷却至约 30 （2） 、接种（ AS3.866 ）液体接种，接种量 5% 无菌操作进行接种摇匀在瓶壁上写上姓名、接种日期（3） 、培养接种后的三角瓶倾斜平放 28培养 24h 扣瓶 （本周四） 继续培养约 2448h 出料（烘干、磨碎）
4、 根霉曲酶液的制备：取 1 克根霉曲溶解到 10 毫升缓冲液中，混合搅拌 10 分钟，纱布过滤，取过滤液备用。绘制标准曲线的方法：先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波长下分别测定它们的吸光度 A。以 A 为横坐标，浓度 c 为纵坐标，则得到一条拟合度较好的直线，称为标准曲线。然后使用用完全相同的方法和步骤测定被测溶液的吸光度，便可从标准曲线上找出对应的被测溶液浓度或含量。0.1%葡萄糖标准曲线的制作取 7 支试管，编号，按照下表进行操作：葡萄糖溶液体积（ml）0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2葡萄糖含量（）0.0 0.2 0.4 0.6 0.8
5、1.0 1.2缓冲液（ml）2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8DNS (ml) 3 3 3 3 3 3 3定容总体积(ml)15 15 15 15 15 15 15OD（540nm）糖化酶酶活测定：取酶液按照下表要求操作测定酶活； 操作步骤 空白管 样品管 A 样品管 B步骤 1 吸取 1.8mL 淀粉底物溶液吸取 1.8mL 淀粉底物溶液吸取 1.8mL 淀粉底物溶液步骤 2 50保温 5 分钟 50保温 5 分钟 50保温 5 分钟步骤 3 加入待测酶液 0.2毫升加入待测酶液 0.2毫升步骤 4 50精确保温10min50精确保温10min50精确保温10min步骤
6、5 加入 3mLDNS 试剂终止反应加入 3mLDNS 试剂终止反应加入 3mLDNS 试剂终止反应步骤 6 混合均匀 混合均匀 混合均匀步骤 7 加入 0.2 毫升待测酶液，沸水浴煮沸 5min沸水浴煮沸 5min 沸水浴煮沸 5min步骤 8 流水冷却 流水冷却 流水冷却步骤 9 加蒸馏水 10mL，混匀加蒸馏水 10mL，混匀加蒸馏水 10mL，混匀步骤 10 OD540nm 比色 OD540nm 比色 OD540nm 比色OD =（A+B） / 2淀粉酶的液化效果试验:取一只试管装入 1 毫升 1%浓度的淀粉底物，50预热 5 分钟，加入酶液1 毫升，反应 5 分钟，取 5 毫升稀碘液
7、检测淀粉显色情况。5、实验现象、结果0.1%葡萄糖标准曲线的制作y = 0.8701x + 0.2108R2 = 0.997600.20.40.60.811.20 0.2 0.4 0.6 0.8 1系 列 1线 性 (系 列 1)线 性 (系 列 1)原理：3， 5-二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，还原糖的量和反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法可测知样品的含糖量。糖化酶酶活测定：5 人/大组 2 人/小组 3 人/小组管号 样品管 A1 样品管 B1 样品管 A2 样品管 B2吸光度 0.558 0.523 0.124 0.167吸光度计算：OD =（A
8、+B）/ 2第一小组 OD=（0.558+0.523）/ 2=0.5405第二小组 OD=（0.124+0.167）/ 2=0.1455淀粉酶的液化效果试验第一小组的两支试管加入碘液都呈无色。糖化酶的酶活力：是指在 PH=6.5，反应温度为 50的条件下，每分钟降解 0.1淀粉产生 1葡萄糖所需的酶量。糖化酶酶活力单位（IU）： 1*2.00)887.(xy= .5435*146.= 9.485 注：5 为测定 OD 值前的稀释倍数；分子中的 10 为根霉曲的稀释倍数；分母中的 10 为反应时间 10min;0.2 为所取的酶量；1 为本实验所取得根霉曲的量。二、实验总结1、注意事项培养基的配
9、制过程中一定要摇匀、拌匀，避免部分地区结成团。在封口过程中一定要按照相关规范进行，避免包扎不严或厚度不够。充分保证灭菌的时长和效果，以免杂菌干扰。灭菌时一定要熟练高压蒸汽灭菌锅的操作，不得违规操作。准备接种时，一定要让培养基冷却至 30以下才能接种，以免杀死菌种。使用超净工作台前进行 2030 分钟的紫外杀菌消毒，使用过程中严格遵守相关操作流程。接种完成后，一定要充分摇动打散瓶内培养基，之后才能放入培养箱中培养。28培养 24h 后要进行扣瓶，以使菌种更好的生长和繁殖。酶活测定注意事项试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落；移液枪的使用：向试管内加入待测酶液或 DNS 时，枪头不要触碰管壁，也不要伸入液面下，连续吸取同一种溶液时可以不用更换枪头！精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时。2、心得体会教师评语及评分： 签名： 年 月 日
