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1、2 型猪链球菌 SrtA 蛋白单克隆抗体的制备与鉴定 丁晨曦 艾乐乐 龚秀芳 胡丹 陈家锋 郭晓璐 潘秀珍 王长军 第三军医大学军事预防医学院 南京军区军事医学研究所 摘 要： 目的 制备并鉴定 2 型猪链球菌 (Streptococcus suis serotype 2, S.suis 2) 强毒株 05ZYH33 分选酶 A (Sortase A, SrtA) 的单克隆抗体。方法 PCR 扩增 2型猪链球菌 05ZYH33 菌株基因组 SrtA 全长, 构建表达质粒 pETDuet-1/SrtA, 导入 E.coli BL21 (DE3) 感受态细胞, IPTG 诱导表达 SrtA 蛋白,
2、 柱纯化后免疫 BALB/c 雌鼠, 采用淋巴细胞杂交瘤技术将免疫小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0 融合, 收集培养上清并制备小鼠腹水, 采用 Western blot 单克隆抗体特异性, ELISA 检测单抗效价。结果 筛选到 1 株能持久、稳定分泌抗 SrtA 蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株, 标记为 1F5, 抗体亚型为 IgM 型/ 链;Western blot 显示该抗体能识别 SrtA 蛋白。结论 成功制备分泌抗 SrtA 蛋白的杂交瘤细胞株, 制备的单抗效价高, 为研究 2 型猪链球菌感染致病过程中 SrtA 的作用奠定了基础。关键词： 2 型猪链球菌; Sortase A; 原
3、核表达; 单克隆抗体; 作者简介：王长军, E-mail:作者简介：丁晨曦 (1989-) , 女, 江苏东台人, 硕士研究生。研究方向:病原微生物。E-mail:收稿日期：2017-08-18基金：国家自然科学基金项目 (No.81471920, 81501725) Preparation and identification of monoclonal antibodies against SrtA ofStreptococcussuisserotype 2 05ZYH33DING Chen-xi AI Le-le GONG Xiu-fang HU Dan CHEN Jia-feng GU
4、O Xiao-lu PAN Xiu-zhen WANG Chang-jun College of Preventive Medicine, Third Military Medical University; Institute of Military Medical Sciences, Nanjing Military Region; Abstract： Objective To prepare and identify the monoclonal antibodies against the Sortase A (SrtA) protein of Streptococcus suis s
5、erotype 2 (S.suis 2) . Methods The SrtA gene was amplified from the genomic DNA of 05 ZYH33 with PCR and cloned into a pETDuet-1 expression plasmid.The recombinant plasmid pETDuet-1/SrtA was transformed into E.coli BL21 (DE3) and its expression was induced with IPTG.The SrtA protein was purified and
6、 used to immunize BALB/c mice.The spleen cells of immunized mice were fused with murine myeloma SP2/0 cells by lymphocyte hybridoma technique.The culture supernatant was collected and mouse ascites was prepared.The specificity of the monoclonal antibody was detected with Western blot analysis, and t
7、he titer was detected with ELISA. Results A hybridoma cell line, designated 1 F5, that consistently and stably secreted anti-SrtA monoclonal antibodies was obtained.The isotype of the monoclonal antibody was IgM with alight chain.Western blot analysis indicated that the monoclonal antibody specifica
8、lly recognized the SrtA protein. Conclusion An anti-SrtA monoclonal antibody was successfully produced with high efficiency (1:204 800) , laying the foundation for the study on the role of SrtA in the pathogenesis of S.suis 2.Keyword： Streptococcus suis 2; Sortase A (SrtA) ; prokaryotic expression;
9、monoclonal antibodies; Received： 2017-08-18猪链球菌 (Streptococcus suis) 革兰染色阳性, 可引起猪脑膜炎、败血症等且病死率较高1。猪链球菌家族成员较多, 根据其荚膜多糖的特点分为 33 个血清型 (131 型, 33 型及 1/2 型) 2, 其中 2 型猪链球菌分布广、致病性强3。目前已发现超过 60 个毒力因子, 如 MRP、SAO、OFS 等。LPXTG 基序作为毒力因子共有的保守基序, 可作为基于组学筛选潜在毒力因子的依据4。Sortase A (SrtA) 为一种分选酶, 能够精确识别和酶解 LPXTG 基序, 并介导上
10、述毒力因子与细菌细胞壁共价结合而发挥致病作用5。研究发现 SrtA 也是通过识别自身的 LPXTG 基序锚定于细菌表面6。Wang 等7-8对 2 型猪链球菌强致病株 05ZYH33 基因组中可能编码 Sortase 或 Sortase 样蛋白的基因进行了系统分析和潜在致病机制研究。本研究拟原核表达 SrtA 蛋白, 通过杂交瘤技术筛选能稳定分泌抗 SrtA 蛋白的单克隆细胞株, 制备和鉴定抗 SrtA 蛋白的单克隆抗体, 为 SrtA 的抗原性研究奠定基础。材料与方法1 材料S.suis 2 菌株 05ZYH33, 蛋白原核表达载体 pETDuet-1 (Amp+, His 标签) 和骨髓瘤
11、细胞 SP2/0 为本室保存;E.coli DH5 和 E.coli BL21 (DE3) 感受态细胞购自北京天根生物有限公司;HAT 和 HT 培养基购自美国 Gibco 公司;聚乙二醇 (PEG-1450) , 弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂均购自美国 Sigma 公司;山羊抗小鼠 IgG-HRP 购自北京博奥森公司;胎牛血清和 DMEM 培养基购自加拿大 Wisent公司;单抗亚型检测 ELISA 试剂盒购自美国 Proteintech 公司;6 周龄 BALB/c 雌鼠购自上海斯莱克公司。2 方法2.1 SrtA 基因扩增及蛋白表达质粒构建与鉴定根据菌株 05ZYH33 基因组中 Srt
12、A 基因序列设计引物。上游引物 SrtA F:5-GGAGCTCGATGT-CAAAACGTGAAAAAAAG-3 (下划线部分为 EcoR酶切位点) ;下游引物 SrtA R:5-AAG-GAAAAAAGCGGCCGCTTATTGTCCATAAT-CATACTG-3 (下划线部分为 Not I 酶切位点) 。PCR 体系 (50l) :模板 2l, 上游引物 1.5l, 下游引物 1.5l, 10Buffer for KOD-Plus-5l, dNTPs 5l, MgSO 42l, KOD-Plus-高保真酶 1l, PCR grade water32l。PCR 反应条件:953min;94
13、15s, 521min, 681min, 30 个循环;6810min。扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳后纯化回收, 纯化产物与 pETDuet-1 载体进行 EcoR和 Not双酶切, 酶切产物在连接酶 Ligation High 作用下连接 1h, 连接产物转化至E.coli DH5 感受态构建成重组质粒。挑取克隆摇菌培养后提取质粒, 进行双酶切鉴定, 鉴定正确的质粒由上海生工公司测序, 测序正确的质粒命名为pETDuet-1/SrtA。2.2 SrtA 蛋白的原核表达及 HPLC 纯化将 pET-Duet-1/SrtA 转化 E.coli BL21 (DE3) , 筛选阳性单菌落于 LB
14、培养基中活化, 按 l50 转接 500ml LB 培养基中增殖至对数生长期, 加终浓度为 0.1 mmol/L IPTG 37诱导 5h, 10 000r/min (离心 rmax=10.8cm) 离心 30min 收菌, 超声破碎, 收集上清和沉淀, 用 12%SDS-PAGE 检测 SrtA 蛋白的表达。上清经镍柱亲和层析纯化后透析浓缩, 得到 SrtA 蛋白, -80保存。2.3 动物免疫将纯化的 SrtA 蛋白调整浓度后与佐剂按 11 比例混合乳化, 对 6 周龄 BALB/c雌鼠进行皮下多点注射免疫, 100g/只, 第 1 次免疫用弗氏完全佐剂, 后改用弗氏不完全佐剂, 剂量与初
15、次免疫相同, 每 2 周免疫 1 次。4 次免疫 7d 后眼眶取血, ELISA 检测血清抗体效价。细胞融合前 3d 小鼠腹腔注射同等剂量蛋白进行加强免疫。2.4 细胞融合、克隆化及腹水的制备以未免疫小鼠分离血清为阴性血清。加强免疫后第 3d, 按照淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合。融合后第 10d 换用 HT 培养基, 以纯化的 SrtA 蛋白为包被抗原, 用 ELISA 筛选阳性细胞克隆株。阳性细胞克隆株用有限稀释法进行 3 次亚克隆, 筛选单一的阳性杂交瘤细胞株。小鼠腹腔注射无菌石蜡油 0.5 ml/只, 10d 后腹腔注射 210 个阳性杂交瘤细胞, 714d 后获得腹水, 离心, 收集
16、腹水上清, 利用饱和硫酸铵沉淀法进行单克隆抗体的粗提。2.5 单克隆抗体效价的测定及抗体亚型的鉴定使用 ELISA 测定腹水单克隆抗体效价;按照抗体亚类试剂盒说明书鉴定单克隆抗体亚型。2.6 抗 SrtA 蛋白单克隆抗体 Western blot 分析纯化的 SrtA 蛋白经 SDS-PAGE 电泳后转硝酸纤维素膜, 用 5%脱脂奶粉 (TBST 配置) 封闭 1h;加入腹水单克隆抗体 (15 000) 孵育 1h, TBST 洗膜 3 次;加入羊抗鼠 IgG-HRP (15 000) 孵育 1h, 同上洗膜;化学发光法显色。结果1 SrtA 基因重组质粒的构建与鉴定PCR 扩增得到 SrtA 的全长片段 (750bp) , 插入 pETDuet-1 载体后提取重组质粒 pETDuet-1/SrtA, 经双酶切鉴定, 酶切片段与目的基因大小相符 (图 1) , 测序
