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1、1.重组 DNA（基因工程）的主要步骤重组 DNA 技术一般包括四步：产生 DNA 片段；DNA 片段与载体 DNA 分子相连接；将重组 DNA 分子导入宿主细胞；选出含有所需要的重组体 DNA 分子的宿主细胞。4.EST 文库的构建基本流程及其应用。EST 是长约 100300 碱基对的 cDNA 片段，是表达基因的一部分。真核生物中比如说人类基因组中，仅有 5%左右的 DNA 是编码序列，所以建立转录图，或从 mRNA 逆转录而来的 cDNA，是分离、定位和克隆基因的关键，这里表达序列标签就具有重要的意义。只要分离到某一发育阶段某一组织的 mRNA，就可以用逆转录法，从 mRNA 合成相应
2、的cDNA 片段，即 EST，用它做探针，就可以从基因组文库中筛选到全长的基因序列。EST的制备程序为：某特异组织总 RNA 的提取Poly（A）+mRNAcDNA两端加接头与 zap 载体连接、包装、裂解转染 E.coli 的 XLIBlue 细胞，进行 in vivo excision 用含有 x-gal 和 IPTG 的氨苄平板筛选随机挑取白色菌落提取质粒M13活 T7 通用引物测序。随着后基因组时代的到来，EST 将用于组织、细胞核亚细胞水平上，研究不同环境状态下的基因表达系统以及生物的系统发育。比较不同的 EST 数据，结合试验方法还可以获得单核苷酸多态性，可以建立更为个性化的基因图
3、谱。这些研究材料将丰富和发展生物信息学，人们将开发模型植物，定位与复杂疾病相关的基因，这将使基因组研究进入一个全新的阶段8.转基因沉默的可能原因转基因植物中转基因沉默已成为植物基因工程的一大障碍，转基因沉默的原因是多方面的，可能是由于转录前外源基因和内源基因的结构特性、伴置效应以及宿主植物的遗传调控；也可能是因为转录时启动子、转录因子和终止子的作用；还可能是由于转录后的修饰作用、外源基因表达特异性和环境等因素。为了克服转基因植物中转基因沉默，可以采取下列对策：选择适宜的外源基因和调控元件、采用适当的转化方法、使用更加简便快捷的筛选策略等。9.RNAi 基本原理及应用10、酵母双杂交的原理和应用
4、。1989 年，Song 和 Field 建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统1 。很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即 DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD） 。这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。不同来源激活因子的 BD 区与 AD 结合后则特异地激活被 BD 结合的基因表达。基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于
5、同一个酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使 AD 与 BD 形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。酵母双杂交技术产生以来，它主要应用在以下几方面：(1）检验一对功能已知蛋白间的相互作用。(2）研究一对蛋白间发生相互作用所必需的结构域。通常需对待测蛋白做点突变或缺失突变的处理。其结果若与结构生物学研究结合则可以极大地促进后者的发展。(3)用已知功能的蛋白基因筛选双杂交 cDNA 文库，以研究蛋白质之间相互作用的传递途径。(4)分析新基因的生物学功能。即以功能未知的新基因去
6、筛选文库。然后根据钓到的已知基因的功能推测该新基因的功能。11、怎样将一个平未端 DNA 片段插入到 EcolRI 限制性位点中去？一种方法，将 EcolRI 限制性位点酶切后补平；另一种方法，重新设计引物加上 EcolRI 限制性位点，然后用 EcolRI 酶切后连接。后者更可行。但是无论怎么连，不能使用同一酶切两断，否则载体自连的效率会远多于你需要的连接，很难挑出阳性克隆。12、酵母单杂交技术的原理和应用。酵母单杂交技术最早是 1993 年由 Li et al 1,2从酵母双杂交技术发展而来，酵母双杂交技术通过对报告基因的表型进行检测以实现对蛋白质间相互作用的研究3-6，而酵母单杂交技术则
7、通过对报告基因的表型检测，分析 DNA、蛋白之间的相互作用，以研究真核细胞内的基因表达调控.目前认为真核生物的转录起始需要转录因子的参与.这些转录因子通常由一个 DNA 特异性结合功能域和一个或多个与其他调控蛋白相互作用的激活功能域组成，即 DNA 结合结构域(DNA-binding domain, BD)和转录激活结构域(activation domain, AD).用于酵母单杂交系统的酵母 GAL4 蛋白即是一种典型的转录因子 .研究2表明 GAL4 的 DNA 结合结构域靠近羧基端,含有几个锌指结构, 可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS); 而转录激活结构域可与 RNA 聚合酶或
8、转录因子 TFIID 相互作用，提高 RNA 聚合酶的活性.在这一过程中，DNA 结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用.据此，我们可将GAL4 的 DNA 结合结构域置换为其他蛋白，只要他能与我们想要了解的目的基因相互作用，就照样可以通过其转录激活结构域激活 RNA 聚合酶，从而启动对下游报告基因的转录.正是基于这一理论，酵母单杂交系统由 2 部分组成：(1)将文库蛋白片段与 GAL4 转录激活域融合表达的 cDNA 文库质粒；(2)含有目的基因和下游报告基因的报告质粒 .在实验中,首先将报告质粒整合入酵母基因组, 产生带有目的基因的酵母报告株; 再将文库质粒转化入报告株;若存在文库
9、蛋白与目的基因的相互作用, 可通过对报告基因的表达将文库蛋白的基因筛选出来.应用.1)鉴别 DNA 结合位点，并发现潜在的结合蛋白基因 目前对于酵母单杂交技术的应用主要体现在这方面. 2)对 DNA 结合结构域进行分析 如果能得到 DNA 结合结构域的结构信息,就可以用酵母单杂交技术对该结构进行分析13、依据 Sanger 的双脱氧链终止法进行 DNA 测序的原理及操作流程。原理是：核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。如此每管反应体系中便合
10、成以共同引物为 5端，以双脱氧碱基为 3端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分四个泳道进行电泳。以分离长短不一的核酸片段(长度相邻者仅差一个碱基)，根据片段 3端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。操作流程:1.分离待测核酸模板，模板可以是 DNA，也可以是 RNA，可以是双链，也可以是单链。 2.在 4 只试管中加入适当的引物、模板、4 种 dNTP(包括放射性标记 dATP，例如?32 PdATP 和 DNA 聚合酶（如以 RNA 为模板，则用反转录酶） ，再在上述 4 只管中分别加入一种一定浓度的 ddNTP(双脱氧核苷酸) 。 3.与单链模板（如以双链作模板，要作变
11、性处理)结合的引物，在 DNA 聚合酶作用下从5端向 3端进行延伸反应，32P 随着引物延长掺入到新合成链中。当 ddNTP 掺入时，由于它在 3位置没有羟基，故不与下一个 dNTP 结合，从而使链延伸终止。ddNTP 在不同位置掺入，因而产生一系列不同长度的新的 DNA 链。 4.用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳同时分离 4 只反应管中的反应产物，由于每一反应管中只加一种 ddNTP(如 ddATP)，则该管中各种长度的 DNA 都终止于该种碱基(如 A)处。所以凝胶电泳中该泳道不同带的 DNA 3 末端都为同一种双脱氧碱基。 5.放射自显影。根据四泳道的编号和每个泳道中 DNA 带的位置直接从自显
12、影图谱上读出与模板链互补的新链序列。 14、Southern 印迹技术的基本原理及其应用。Southern 印迹杂交是进行基因组 DNA 特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的 DNA 片段，将胶上的 DNA 变性并在原位将单链 DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定 DNA 分子的含量.应用: 1.遗传病诊断2.DNA 图谱分析3.PCR 产物分析15、Northern 印迹技术的基本原理及其应用。Northern 杂交(Northern Hybridizat
13、ion)是分析 RNA 的一种方法, 它的基本原理是将RNA 样品通过变性琼脂糖凝胶电泳进行分离 ,再转移到尼龙膜等固相膜载体上, 用放射性同位素标记的 DNA 或 RNA 特异探针对固定于膜上的 mRNA 进行杂交, 洗膜去除非特异性杂交信号,经放射自显影,对杂交信号进行分析。将杂交的 mRNA 分子在电泳中的迁移位置与标准分子量分子进行比较,即可知道细胞中特定的基因转录产物的大小,对杂交信号的强弱比较, 可以知道该基因表达 mRNA 的强弱。这一技术应用十分广泛,常用于基因表达调控、基因结构与功能、遗传变异及病理研究。主要用来检测外源基因在受体细胞中是否转录成RNA。16、Western
14、印迹技术的基本原理及其应用。17、什么是蓝白斑筛选法？蓝白斑筛选法为什么也会有假阳性？可以用什么方法来进一步确定真假阳性？蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法，是根据载体的遗传特征筛选重组子，如 -互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的 DNA 的短区段，其中有 -半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前 146 个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS） ，它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到 -半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码 -半乳糖苷酶 C 端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，
15、可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ 基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为 -互补。由 - 互补而产生的 LacZ+细菌在诱导剂 IPTG 的作用下，在生色底物 X-Gal 存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源 DNA 插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无 -互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。转化时未进入菌体内的小片段 DNA 存在于受体菌上或涂溅在抗性平板菌落周边上。样品污染、扩增试剂污染、扩增产物交叉污染等。常见的污染来源包括实验室环境、加样器、操作中形成的喷雾、 试剂及任何与扩增产物接触的东西。18、如何以大肠杆菌质粒 DNA 为载体克隆一个编码动物激素的基因，并在大肠杆菌中表达？简要说明实验过程中可能会遇到的问题及可能解决方法。根据所要克隆基因序列设计并合成引物，提取表达该基因的动物组织的 RNA，反转录做RT-PCR，PCR 产物克隆到 TA 载体上（大肠杆菌中） 。19、用 A 链和 B 链分别表达法重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建。20、人胰岛素原表达法重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建。21、A 链和 B 链同时表达法重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建。N C
