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1、医学论文-去细胞牛松质骨复合骨髓基质干细胞修复兔桡骨缺损作者：王德超 郑玉琴 孙建华 史晨辉 董金波 刘维钢 【摘要】 目的：研制理想的能够修复骨缺损的骨材料，为其在骨缺损修复领域中的临床应用提供实验依据。方法：体 外扩增诱导兔骨髓基质干细胞，将其与去细胞牛松质骨复合培养。造成兔桡骨中段 10 mm 骨缺损模型，分复合细胞组、 单纯材料组、空白对照 组。通过大体观察、放射学检查、组织学检查观察骨缺损的修复情况。 结果：去细胞牛松质骨复合骨髓基质干细胞修复兔桡骨缺损，12 周时缺损区完全被新骨代替，骨髓腔完全通畅， 优于单纯材料组的修复效果， 单纯材料组优于空白对照组。结论：去细胞牛松质骨具有良
2、好的成骨能力，有可能成为理想的骨支架材料。 【关键词】 骨修复材料；去细胞牛松质骨；组织工程Abstract Objective To prepare an ideal scaffold material for the repair of bone defect, for the clinical use in the bone reconstruction field. Methods Rabbit marrow stem cells (MSCs) were cultured and expanded in vitro. The MSCs were mixed with acellular
3、 bovine cancellous bone (ABCB). The rabbits were prepared as model of bone defects, divided into 3 groups:named complex group, acellular bovine cancellous bone group, and blank control. The animals were sacrificed and new bone regeneration in the defects was investigated by gross specimen inspection
4、, X-ray examination and histological observation. Results At 12 weeks, the radial defects repaired by named complex group, and their marrow cavities formed, which is better than acellular bovine cancellous bone group. Acellular bovine cancellous bone group is better than blank control. Conclusion Ac
5、ellular bovine cancellous bone may be used as a kind of ideal scaffold material.Key Words Bone repair material; Acellular bovine cancellous bone; Bone tissue engineering研制理想的生物材料替代自体骨移植用于修复骨组织缺损是医学和生物材料科学领域的一个重要课题。目前临床上应用的骨移植物较多，如羟基磷灰石、脱 钙骨、脱蛋白骨等为临床骨缺损的治疗提供了很多选择。但是这些方法各有优缺点，难以满足临床上修复各种骨缺损的需要。去 细胞牛松质
6、骨作为新型的生物衍生支架材料，具有良好的力学性质、空 间结构、降解性、生物相容性等特点，日益受到重视。本研究将兔骨髓间充质干细胞（MSCs）与去细胞牛松质骨载体相结合，构建组织工程骨，探索修复兔桡骨节段性骨缺损的可行性。1 材料与方法 1.1 材料1.1.1 材料与试剂 新鲜牛肱骨（石河子市农贸市场），脱细胞的各种试剂（曲拉通 X-100 由上海生物工程公司提供，氯化钠由西安化学试剂厂提供）， HWY 100B 型恒温培养摇床（上海智城分析仪器制造有限公司），Massion 染色试剂盒（广州市俪科贸易有限公司），新西兰大白兔（石河子大学实验动物中心），胰酶（华美），地塞米松（Sigma），维生
7、素 C（Sigma），- 甘油磷酸钠（Sigma），低糖 DMEM 培养基（GIBCO 公司），新生牛血清（Hyclone，美国），小牛白蛋白血清（ Sigma），60Co 辐射源（加拿大），倒置荧光显微镜（Olympus ），电镜 （LEO-1430VP，德国）。1.1.2 牛松质骨标本的准备 取新鲜牛肱骨 1/3 段，制成 1.5 cm0.5 cm 0.5 cm 大小， 50自来水反复冲洗 3 次后，蒸 馏水冲洗 3 次，置于 PBS 保存液中，在适宜的温度、pH 值条件下，采用 10% 高渗生理盐水和去污剂 TritonX-100 对牛肱骨进行组织工程学的去细胞处理。包装后 60Co 照
8、射（20 kGy）备用。1.2 方法1.2.1 骨髓基质干细胞的分离、培养、诱导鉴定 1 月龄新西兰大白兔， 3% 戊巴比妥钠腹腔麻醉，无菌条件下取双侧股骨，用含有肝素的 PBS 缓冲溶液冲洗骨髓腔，冲洗液 5 mL 缓慢加到已加入了5 mL 淋巴细胞分离液的 10 mL 离心管中，2 000 r/min，离心 30 min，用吹打管轻轻取其界面云雾层液面， PBS 漂洗，1 500 r/min 离心 5 min，弃上清，加入基础培养液 DMEM 10 mL，制成单细胞悬液，3106/mL 接种于 75 mL 培养瓶内，加 5 mL 20% 胎牛血清的低糖 DMEM 培养基，置于 5% C O
9、2、37 饱和湿度的 CO2 孵箱中进行培养，72 h 后全量换液。以后每隔 72 h 换液 1 次。待贴壁细胞融合达 80%90% 后，0.25% 胰蛋白酶 37 下消化，进行传代、扩增培养。收集第 3 代 BMSCs，以 2104/mL 的密度培养于诱导培养液（含 20% 新生牛血清，10-8 mol/L 地塞米松，50 L/mL 维生素 C ，10 mmol/L - 甘油磷酸钠）。同 时以同样 密度细胞培养于 20% 新生牛血清低糖 DMEM（L-DMEM）培养液为对照。在第21 天分别取出贴壁生长有细胞的盖玻片，使用 75% 乙醇固定液固定 30 min。三蒸水冲洗，用 5% 的硝酸银
10、染色，避光，室温孵育 30 min。再以三蒸水冲洗，在紫外灯下照射 30 min。以 1% 中性红溶液染色 30 s 。1.2.2 BMSCs 细胞与 ABCB 复合培养 收集第3 代 BMSCs，加入含成骨 细胞 诱导液的条件培养基培养 3 d，制成 5106/mL 浓度的细胞悬液进行接种，每孔 2 mL。利用抽吸作用力使细胞充分渗入ABCB 孔隙中，在 37 、5% CO2 饱和湿度条件下联合培养，8 h 后再次加培养液，其后隔日换液。复合培养 3 d。 1.2.3 采用健康成年新西兰大白兔 27 只，重2.22.5 kg，无菌条件下造成桡骨中段 10 mm 骨缺损模型。先取 18 只，将
11、直径 5 mm、长 10 mm 的复合骨髓基质干细胞牛去细胞骨植入左侧骨缺损处，右侧单纯植牛去细胞骨；再取 9 只，双侧留做空白对照。 术后肢体不作外固定。每日肌注青霉素 20 万U，连续 3 d。术后 4、8、 12 周每个时间点实验组 6 只，对照组 3 只，分 别拍 X 片，然后处死动物取材。标本经 10% 福尔马林固定后，硝酸脱钙，石蜡包埋，5 m 连续切片。1.2.4 观察指标 细胞培养过程及术后一般观察、X 线片分析、大体标本观察、HE 染色观察。1.2.4 统计学处理 结果以均数标准差表示，采用 SPSS 13.0 统计软件包进行 t 检验，P 单纯材料组 空白对照组。术后12
12、周，复合细胞组和单纯材料组均形成髓腔结构，前者修复区的皮质骨平直（图 2），后者存在凹陷（图 3），空白对照组呈骨不连。按照 Lane-Sandhu1 标准评分。结果发现，4、 8、12 周复合细胞组 单纯 材料组 空白对照组，有显著性差异 （P 单纯 材料组 空白对照组，有显著性差异（P 0.05）。3 讨 论理想的骨组织工程细胞外基质材料应具有良好的生物相容性和可降解性、合适的三维多孔结构、较强的骨诱导性、良好的可塑性和适当的机械强度，尤其是作为管状骨的修复材料2。提供移植的材料多种多样，但理想的骨缺损修复材料，尤其是修复大段骨缺损的移植材料仍是骨科面临的重要课题。异种骨由于来源广泛和经济
13、简便，在解剖形状、组织结构等方面具有无法比拟的优越性，一直是骨修复工作者热衷于研制开发的植骨材料，然而异种骨的免疫排斥反应妨碍植骨与骨缺损区域直接接触，破坏植骨成分，导致植骨吸收。 如何消除异种骨的抗原性，同时保留其成骨能力，是异种骨移植的核心问题。 罗卓荆3等通过对 松质骨抗原性的研究发现，在骨小梁骨基质染色阴性，而骨细胞、成骨细胞、 软骨细胞及骨陷窝等均有不同程度的阳性染色。也就是 说，各种细胞成分是松质骨中抗原的主要成分。常用的去细胞方法有酶消化法、渗透溶液法和去污清洗法。笔者采用 10% 高渗生理盐水和去污剂 TritonX-100 联合对牛肱骨进行组织工程学的去细胞处理。去细胞基质骨
14、有效地去除异种骨引起免疫排斥反应的细胞成分，清洁骨陷窝壁， 选择性地保留抗原性相对较弱的网状骨基质结构，降低了移植骨的免疫原性。为了寻求理想的修复材料，课题组采用自制的去细胞牛骨作为兔骨髓基质干细胞载体复合移植于体内骨缺损处，以观察其成骨潜能和吸收降解情况，旨在为今后的实验和临床应用提供依据。MSCs 是骨髓中的一类多能干细胞，具有分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪 细胞甚至神经细胞等多种潜能，可在地塞米松、维生素 C、- 甘油磷酸钠等诱导下向成骨细胞分化，是构建组织工程骨的重要细胞 。应用 MSCs 修复骨缺 损的组织工程方法一般是将 MSCs 与支架材料复合后植入缺损区，或先将 MSCs 诱导
15、分化为成骨细胞后再与支架材料复合并植入缺损区。我们所采用的将 MSCs 诱导分化为成骨细胞后和去细胞牛骨复合在一起的方法，此前尚未见报道。以往的研究发现：生物衍生骨孔隙率高，可有效地为种子细胞黏附、分化和成骨提供良好场所。生物衍生骨植入骨缺损区后，随着 诱导成骨作用、骨 传导作用的完成而逐渐降解，其逐步降解的特点与新骨形成的过程相吻合。本实验中将骨髓基质干细胞诱导培养后，接种于支架材料上，植入骨缺损处， 发挥其最大成骨活性。在体内微循环环境影响、应力作用及血液供应等条件下，组织工程骨可同时发挥骨传导、骨诱导成骨作用，从而修复骨缺损。通过放射学检查、大体观察及组织学检查均表明，组织工程骨的成骨及塑形能力较强。4、 8 周复合细胞组有大量骨痂形成 ，12 周时骨塑形好，提示组织工程骨成骨较快，新骨塑形、改建迅速；而 单纯材料组只是通过支架材料的骨传导作用促进成骨，所以新骨形成较慢；空白对照组各缺损区均未愈合。寻找能同时满足生物相容性良好、有利于细胞黏附生长、且有一定的孔隙率并具备相当的降解速率的生物支架材料是组织工程的重点。本文作者认为用骨髓基质干细胞复
