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1、在一个全面的生物营养物去除装置里检索海绵填料生物膜中硝化、反硝化和厌氧氨氧化细菌的生存空间分布Kyu-Jung Chae Sung-Min Kim Sang-Eun Oh Xianghao Ren Jinwook Lee In S. Kim摘要：空间分布和硝化和反硝化细菌的活动，海绵介质采用不同的调查工具，在海绵相的原位微生物状况的了解，因为是海绵媒体处理的成功设计和运行的关键。媒体内的细菌财团是由不同的群体，包括14.5的亚硝化spp.般的氨氧化菌（AOB），12.5Nitrobacterspp.般的亚硝酸盐氧化菌（NOB），2.0厌氧氨氧化（ANAMMOX）菌和71.0，其他细菌。生物膜似
2、乎是最稠密的介质的相对外侧区域和逐渐随深度减小，但细菌存活率显示空间无关的特征。原位杂交结果的荧光显示， AOB和NOB共存于类似数量的媒体，这是合理的微电极测量出氨氮的伴随氧化和生产的NO3-在这个区域支撑的侧片段。然而，AOB的显著更高的级分中观察到比中心侧片段。作为与整体生物膜密度分布，反硝化细菌也上侧更丰富比在中心的片段。在整个深度检测厌氧氨氧化细菌提供了另一种优势，通过同时将氨氮和NO2转化为氮气ofnitrogen去除。关键词：细菌多样性 FISH Nitrifying细菌 空间分布 Sponge媒体引言其中包括固定膜介质（例如，固定媒体或自由浮动的媒体）转换为活性污泥工艺集成固定
3、膜活性污泥法（ IFAS ）混合动力系统被认为是一个具有成本效益的替代改造，无需额外的建设，增加流域音量该自由浮动的媒体系统被更频繁地选择为比固定媒体处理大型污水处理厂的，因为它简单的升级。海绵介质填充到一个aerobicbasin不仅提升硝化作用，而且还用于去除有机物。影响海绵媒体升级的整体设计因素包括：媒体填充率，盆配置，曝气模式（完整的地板覆盖与螺旋卷）和类型（微细气泡与粗泡）和运营溶解氧（DO）浓度。在这些因素中，正确的介质填充率的测定是在海绵介质过程的设计的最重要的方面之一，因为媒体本身是昂贵的。如果细菌财团，活动及其多样性足够的信息是可用的，更精确的设计可以实现，无需过度或不足使用
4、海绵介质的灌装。微生物的硝化和反硝化随后是从废水中去除氨氮的关键过程。然而，硝化不足经常是由于生长速度缓慢和硝化细菌的敏感性，运行条件发生。因此，更好地理解和硝化生物膜中反硝化细菌是提高海绵介质流程的性能的一个重要因素。一些研究人员已经研究了细菌的分布，实验室或中试条件下生物膜内的物种，但不能在一个全规模经营独立财务顾问系统。AOB，属Nitrosomoasspp。分别在整个生物膜检测，而NOB （硝化螺状菌），主要发现在对一个实验室规模的旋转盘反应器生活污水生物膜内的部件。偶尔，由于氧转移的限制，一个缺氧区被海绵介质内形成。这会导致一定程度的生物反硝化作用于它通过常规的反硝化菌和/或厌氧氨氧
5、化细菌，这取决于两个DO浓度上，保持在周围的液体以及反硝化细菌的数量。在有氧盆地内媒体的denitrificaiton，特别是被称为好氧反硝化，可以允许在缺氧盆地的体积可能减少。因此，进一步考虑反硝化菌是必需的，即使它们不是主要的。FISH和实时PCR技术已经被应用于不同的细菌种群在各种环境中的快速鉴定和定量。微电极也是有用到生物膜内确定各种微生物的活性。细胞色素CD1-亚硝酸盐还原酶：生物反硝化过程是由两种不同类型的亚硝酸盐还原酶的酶进行,由NIRS基因，以及一个铜亚硝酸盐还原酶的nirK基因的基因编码的编码。近红外光谱比nirK基因分布更加广泛和这两个基因似乎相互排斥发生在一个给定的应变。
6、涉及的16S rRNA的做法是不恰当的，因为反硝化细菌不被密切亲缘关系的定义。因此，在本研究中，实时PCR针对NIRS基因，而不是16S rRNA基因进行定量反硝化细菌。有时，海绵介质的内部区域由细菌不被占用，但仍空置由于传质限制，这取决于孔的大小和海绵立方体/ O大小。在这种情况下，空间分布的调查可以提供重要的信息用于判定海绵立方体的合适尺寸或大小，以避免该中心区域内的空间中的不期望的浪费。此外，细菌作为深度的函数的生存能力是为有效利用整个介质空间的评价是必不可少的。然而，关于这些问题的资料很少。因此，在本研究中，海绵介质的样品（在下文中BioCube）从一个全规模的工厂进行分析,他们的硝化
7、和反硝化细菌群落，以及空间分布和细菌生存能力用鱼，实时定量PCR，微电极和活的死的可行性染色的组合。材料和方法BioCube海绵介质样品BioCube是自由浮动的多孔聚氨酯的立方体（15毫米，每英寸33孔，大约的空隙空间。 95）与伪两性亲水化剂12。 BioCube样本（每个实验30立方），随机取自“D”城镇污水处理厂（30万立方米/天=平均流量）在韩国的使用BioCube已经升级并运营超过10个月的去除氮和有机物。现有的活化污泥池被分成三个顺序盆：厌氧，缺氧和有氧与安装在有氧盆以15的填充体积分数（图1a） BioCube媒体。由于媒体的举动自由地在整个曝气池，屏幕被安装到留住他们的盆地内
8、。该工厂的总水力停留时间（HRT）下操作6.0小时到治疗的平均初级净化污水的生化需氧量（BOD）的163.0,208.2悬浮固体（SS），4.9 mg / L的总氮31.8（TN），19.7氨氮和总磷（TP）。内部硝酸盐的回收利用。微电极的制备和测量确定有关的深度，离子选择性微电极与5流明尖端直径为NH 4和BioCube海绵介质内的离子梯度NO 3 - 是按照先前描述的方法制备。该BioCube样品，用全面发展的生物膜，分别置于内的一个专门设计的测量室 。在测量室中填充的从BioCube填充有氧盆混合液滤液，本体溶液，然后充分充氧30分钟引入BioCube样品之前。在本体溶液中的溶解氧浓度在
9、整个测量过程中保持在约5.5毫克/升。 微电极是用一个马达驱动的微操作器的10流明的精度插入垂直成thesample立方体。经过微电极的尖端触及的目标位置，读数分别取自微传感器（钻石一般的化学微传感器1231，美国）。FISH分析BioCube海绵切成27相同的片段（5毫米的立方体），1个中心，并围绕中心26侧的片段，用微切片机，调查了微生物的多样性的空间进行访问。鱼和实时PCR分析，中心段及侧片段使用。每个片段浸在1毫升PBS中，并强烈涡旋，提取该生物膜。将1毫升提取液作为样品同时为FISH和实时PCR分析。对于FISH， 200 LL的样品提取物均在13,000 rpm离心3分钟。除去上清
10、液后，将沉淀物过夜，4 4 C在1毫升4 的多聚甲醛固定，重新悬浮，然后将FISH协议进行如先前described.using的16S rRNA基因定位的寡核苷酸探针 。杂交后，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM ，卡尔蔡司，LSM 5 PASCAL），配有氩激光（458/488/514纳米），绿色氦/氖激光（543 nm）和红色氦/氖激光（633纳米）是用于可视化的FISH图像。分析了硝化细菌的组成，数字图像分析仪（iSolution /精简版软件,IMT的i-溶液，韩国）用于随机测量的属特异性荧光标记的细菌在图像帧中的荧光区域在激光共聚焦显微镜观察获得的。相应AOB和NOB的丰度表示为荧光区域
11、，以通过所有的细菌所占据的分数。实时荧光定量PCR分析基因组DNA使用一个AccuPrep基因组DNA提取试剂盒（K- 3032 ，Bioneer公司，韩国） BioCube样品中提取并用作模板DNA的实时PCR ，其中使用分光光度计定量（ Ultraspec 3100pro ， Pharmacia公司，瑞典）在260nm处。表2示出了在信息,引物用于扩增NIRS片段。作为初步测试，系统发育多样化的反硝化和非反硝化细菌进行了测试的特异性在我们的研究中使用的nirS2F/nirS3R引物组。实时PCR进行了使用转子基因3000（科贝特研究，USA），用SYBR绿作为检测系统。各反应混合物由25 LL ，包括0.5莫耳的每种引物，分别为12.5纳克从中心和侧面片段的样品，模板DNA和1.25 LL的SYBR Green PCR主混合物的（QuantiTect SYBR绿色PCR试剂盒， QIAGEN公司，法国）。该酶活化15分钟，95 后，分别进行变性的40个循环15秒，在95 C，退火30秒在58摄氏度和延伸30秒72下的扩增产物的纯度是由在熔融步骤期间观测为单峰检查。
