液质联用技术在药物杂质结构分析中的应用

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1、液质联用技术在药物杂质结构分析中的应用吡格列酮杂质结构分析(雍 春 310011)摘要 目的：要求对吡格列酮 4.800min 杂质-A（相对保留时间为 RRT=0.55）和7.550min（相对保留时间为 RRT=0.87）杂质-B 进行研究，确定其结构。方法：通过对杂质的提取提高杂质的含量，通过液质联用技术对杂质进行结构分析。结果：成功地确认了多个研究杂质的结构。关键词： 杂质 提取 液质联用技术 结构分析在药物质量研究中，有机杂质的研究成为制约药物深入研究的重点及难点。随着液质联用技术的广泛应用，液质联用技术越来越成为药物杂质结构研究的有力手段。本文通过对杂质一系列的有效提取，提高了杂质

2、的含量，同时提高了其在质谱多级裂解中的响应，并通过液质联用技术成功地确认了多个研究杂质的结构。一、杂质研究目的要求要求对吡格列酮 4.800min 杂质-A（相对保留时间为 RRT=0.55）和 7.550min（相对保留时间为 RRT=0.87）杂质 -B 进行研究，确定其结构。 （附 图 1）二、仪器及试药仪器：Agilent1100 高效液相色谱仪，质谱仪，旋转蒸发仪试药：乙醇（分析纯） ，正己烷（分析纯） ，正丁醇（分析纯） ，醋酸（分析纯） ，乙腈（色谱纯） ，氨水（分析纯） ，水（重蒸水） 。三、杂质的提取吡格列酮氢化母液（附 图2）加加加加吡格列酮滤液（含4.6min杂质A约3.

3、6%）加加加加二氧六环母液样品下层液杂质-D提取液 正己烷层（上层）含6.9min杂质-D可高达54% （附 图3）稠状物 23上层为有色层（有机层）收集下层水层 23.5min-C杂质-A提取液 4.6min杂质-A 含量可达约30%。 （附 图4 ）四、杂质的结构分析分析色谱条件 1：色谱柱：依利特 Hypersil ODS2 2504.6mm 5m流动相：乙腈-水-醋酸=500：500：1.2（用氨试液调节 pH6.0）分析色谱条件 2：色谱柱：依利特 Hypersil ODS2 2504.6mm 5m流动相：乙腈-水-醋酸=420：580：0.9（用氨试液调节 pH6.2）LC-MS

4、分析色谱柱均为依利特 Hypersil ODS2 2504.6mm 5m1、 峰位的确认及分子量初步分析(LC-MS 分析)：取吡格列酮样品分别于色谱条件 1 和色谱条件 2 下进样分析，并取吡格列酮样品于色谱条件 2 下进行 LC-MS 分析。结果见下表 1。表 1 杂质的出峰位置的确认及分子量初步分析(LC-MS 分析)色谱条件 成分 保留时间(RT) 相对保留时间 分子量(RRT)杂质 A 4.669min 0.57 /色谱条件 1(附图 5) 杂质 B 7.177 min 0.88 /杂质 A 6.734min 0.45 /色谱条件 2(附图 6) 杂质 B 12.432min 0.8

5、4 /杂质 A 6.296min 0.45 298色谱条件 2LC-MS (图 7) 杂质 B 11.563 min 0.83 3262、 母液的 LC-MS 分析：取吡格列酮母液于色谱条件 1 下进行色谱分析，在梯度条件下进行 LC-MS 分析，结果见下表 2。表 2 母液的色谱分析和 LC-MS 分析色谱条件 成分 保留时间(RT) 相对保留时间(RRT) 分子量杂质 A 4.694min 0.56杂质 B 7.276min 0.87色谱条件 1(附图 2)杂质 D 7.507min 0.90/杂质 A 7.186min 0.56 298杂质 B 13.143min 1.03 326杂质

6、E 8.283min 0.65 257LC-MS 分析（梯度洗脱）(附图 8) 杂质 D 11.677 min 0.91 135由于 LC-MS 色谱系统的变化( 如调节流动相 pH 误差较大) 会使出峰时间顺序发生变化，这在吡格列酮分析方法学研究中得到证实，所以 LC-MS 中分子量为326 保留时间为 13.143 min 的杂质应为图 2 中 7.276 min 杂质 B。3、 样品及杂质 LC-MS/MS 分析：（1） 对吡格列酮 050602 批样品的分析：取吡格列酮 050602 批样品于色谱条件1 下进行液相色谱分析，并进行 LC-MS/MS 分析，结果见下表 3。表 3 吡格列

7、酮 050602 批样品的色谱分析和 LC-MS/MS 分析色谱条件 成分 保留时间(RT) 相对保留时间(RRT) 分子量杂质 A 4.688min 0.56杂质 B 7.268min 0.87色谱条件 1(附图 9)杂质 E 6.720min 0.81杂质 A 6.081min 0.62 298杂质 B 主峰后 / 326LC-MS 分析(流动相为乙腈- 水-冰乙酸=450：550：1.2(用氨试液调节 pH6.0)(附图 10)杂质 E 7.038min 0.72 257根据样品图中三个主要杂质相对应，并结合前面分析可以推测出图 10 中7.038min 质量数为 257 杂质即为图 9

8、 中 6.720min RRT=0.8072 杂质 E；图 10 中主峰后质量数为 326 杂质即为图 9 中 7.268min 杂质 B。7.038 min 杂质 E，其分子量为 257，其结构可能为醚化物醛基氢化成为羟基的化合物。C16H19NO2 M=257NC2H5 CH22O CH2O（2） 对分子量为 298 的杂质 A 提取液的 LC-MS/MS 分析：取杂质 A 提取液进行 LC-MS/MS 分析并与盐酸吡格列酮的 LC-MS/MS 谱图和盐酸吡格列酮26 min 色谱制备杂质的 LC-MS/MS/MS 比较，结果见下表 4。表 5 分子量为 298 的杂质 A 提取液的 LC

9、-MS/MS 分析成分 保留时间(RT)相对保留时间(RRT)分子量 一级电离m/z二级电离 m/z 三级电离 m/z杂质A6.071min(附图 11)0.62 298 299.0 118.9、133.9、239.8、281.8/盐酸吡格列酮(附图 14)356 357.2 119.2、134.1、240、241.1、286.1/盐酸吡格列酮后峰色谱制备杂质( 附图 15)489 490.4 357.3 119.3、134.2、177.1、250.1根据对分子量为 298 的杂质 A 进行的 LC-MS/MS 分析(附 图 11)，与盐酸吡格列酮( 附 图 14)含有共同的 m/z118.9

10、、m/z134、m/z240 碎片离子峰，这与盐酸吡格列酮及其后峰色谱制备杂质的裂解(附 图 15)一致，都有 m/z118.9、m/z134 碎片离子峰，证明有极为相似的结构，由于 m/z134 碎片离子中含有一个 N 原子，分子量为偶数，根据氮规则不可能只含一个 N 原子，应该至少还含有一个 N 原子；又根据 m/z281.8 的碎片离子峰的裂解，丢失碎片推测可能是含一个氨基。根据吡格列酮结构与氢化工艺的分析，其可能结构为吡格列酮氢化脱去硫和羰基后的产物，C18H22N2O2 M=298NC2H5 CH22O CH22CONH2其可能裂解如下： NC2H5 CH22O CH22CONH2m

11、/z118.9 碎片离子可能为氢重排后的碎片离子 。O CH+CH2（3） 对母液中 RRT=0.9023 杂质-D 提取液的 LC-MS/MS 分析：取杂质-D 提取液进行 LC-MS/MS 分析，结果见下表 5。表 5 杂质-D 提取液的 LC-MS/MS 分析（附图 12、图 13）成分 保留时间(RT) 分子量 一级电离 m/z 二级电离 m/z杂质 B 9.329min 326 327.0 133.9、281.0、282、298.9杂质-D 9.835min 135 135.9 120.8、 346.8、525.6据对母液中 RRT=0.9023 杂质 -D 提取液的 LC-MS/M

12、S 分析，该杂质-D 分子量为 135， M+H=135.9，有可能为 2，5- 二乙基吡啶，裂解可丢失一个甲基自由基，得到M+H+=120.8 的碎片离子，裂解后可能形成聚合物而得到m/z346.8、m/z525.6 的碎片离子。结构可能为C9H13N M=135NC2H5 C2H5可能由于裂解过程中形成自由基而发生聚合(附 图 13)。表 6 杂质-B 的峰位置确认色谱条件 样品来源 附图 保留时间(RT)相对吡格列酮保留时间(RRT)相对杂质-D 保留时间(RRT)色谱条件 1 目标样图 图 1 7.550min 0.87 /色谱条件 1 母液 图 2 7.276min 0.87 0.9

13、7色谱条件 1 杂质-D 提取液 图 3 6.602 min 0.89 0.96LC-MS/MS 杂质-D 提取液 图 12 9.392 min / 0.96根据其 9.329 min 杂质-B 的 LC-MS/MS 分析，可以确认该杂质即为目标样图1 中所需研究相对保留时间(RRT)为 0.87 的杂质，其分子量为 326，其裂解与分子量为 298 的杂质 A 极为相似，有共同的碎片离子峰 m/z133.9、m/z282、m/z298.9再根据吡格列酮与其氢化工艺的分析，推测其结构可能为吡格列酮氢化脱硫化合物。C19H22N2O3 M=326NC2H5 CH22O CH22CONHCO附：

14、吡格列酮结构如下：NH3C O SNHOOM=356吡格列酮 26min 杂质结构如下：NH3C O SNOOM=489 NCH3五、盐酸吡格列酮合成工艺路线：NC2H5 CH22OH3S2ClN2H5 CH22OS2CH3KOCHONH3C O SNHOOH2Pd/C NH3C O SNHOOHClNH3C O SNHOO.HClNC2H5 CH22OCHOSNOO() ()() ()()()根据工艺分析，结合盐酸吡格列酮合成技术人员的分析，在合成工艺氢化反应中中是有可能产生杂质 A 和杂质 B 的。六、4.6 min（RRT=0.56 ）杂质详细可能裂解过程分析：(1) NC2H5 CH2

15、2OCH22CONH2 加 H+M=298NC2H5 CH22OCH22CONH2H+m/z 29 NC2H5 CH22+m/z 134+CH22CONH2HONC2H5 CH23+ CH22CONH2O+O CH+CH2CONH2 O CH+CH2m/z 19H(2) NC2H5 CH22O CH22CONH2 加 H+M=298NC2H5 CH22O CH22CNH2m/z 29 OH+-NH3-17NC2H5 CH22O CH22Cm/z 28 O+NC2H5 CH22O CH2m/z 240 +H2CCO(3) NC2H5 CH22O CH22CONH2 加 H+M=298NC2H5

16、CH22O CH22CNH2m/z 29 OH+NC2H5 CH22O CH2m/z 240 +H3CCONH2根据 4.6min 杂质 A 的裂解途径分析，杂质 A 的分析结构是有合理性。 裂解途径以（1） 、 （2）占优势，裂解途径（3）几率很小，几乎不可能。七、结论：1、样品中杂质：根据分析吡格列酮中 4.69min（RRT=0.56）杂质 A 结构为C18H22N2O2 M=298NC2H5 CH22O CH22CONH27.27 min（RRT=0.87 ）杂质 B 结构为C19H22N2O3 M=326NC2H5 CH22O CH22CONHCO2、母液中杂质：样品及母液中 6.7 min