测量显微镜的发展与历史

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1、测量显微镜的发展与历史早在公元前一世纪，人们就已发现通过球形透明物体去观察微小物体时，可以使其放大成像。后来逐渐对球形玻璃表面能使物体放大成像的规律有了认识。1590 年，荷兰和意大利的眼镜制造者已经造出类似测量显微镜的放大仪器。1610 年前后，意大利的伽利略和德国的开普勒在研究望远镜的同时，改变物镜和目镜之间的距离，得出合理的显微镜光路结构，当时的光学工匠遂纷纷从事显微镜的制造、推广和改进。17 世纪中叶，英国的胡克和荷兰的列文胡克，都对测量显微镜的发展作出了卓越的贡献。1665 年前后，胡克在显微镜中加入粗动和微动调焦机构、照明系统和承载标本片的工作台。这些部件经过不断改进，成为现代测量

2、显微镜的基本组成部分。 16731677 年期间，列文胡克制成单组元放大镜式的高倍显微镜，其中九台保存至今。胡克和列文胡克利用自制的显微镜，在动、植物机体微观结构的研究方面取得了杰出成就。19 世纪，高质量消色差浸液物镜的出现，使显微镜观察微细结构的能力大为提高。1827 年阿米奇第一个采用了浸液物镜。19 世纪 70 年代，德国人阿贝奠定了测量显微镜成像的古典理论基础。这些都促进了显微镜制造和显微观察技术的迅速发展，并为 19 世纪后半叶包括科赫、巴斯德等在内的生物学家和医学家发现细菌和微生物提供了有力的工具。 在显微镜本身结构发展的同时，显微观察技术也在不断创新：1850 年出现了偏光显微

3、术;1893 年出现了干涉显微术;1935 年荷兰物理学家泽尔尼克创造了相衬显微术，他为此在 1953 年获得了诺贝尔物理学奖。 古典的光学显微镜只是光学元件和精密机械元件的组合，它以人眼作为接收器来观察放大的像。后来在显微镜中加入了摄影装置，以感光胶片作为可以记录和存储的接收器。现代又普遍采用光电元件、电视摄像管和电荷耦合器等作为显微镜的接收器，配以微型电子计算机后构成完整的图像信息采集和处理系统。 目前全世界最主要的显微镜厂家主要有：奥林巴斯、蔡司、徕卡、尼康。国内厂家主要有：江南、麦克奥迪等。二、 测量显微镜的基本光学原理(一) 折射和折射率 光线在均匀的各向同性介质中，两点之间以直线传

4、播，当通过不同密度介质的透明物体时，则发生折射现象，这是由于光在不同介质的传播速度不同造成的。当与透明物面不垂直的光线由空气射入透明物体(如玻璃)时，光线在其介面改变了方向，并和法线构成折射角。(二) 透镜的性能 透镜是组成显微镜光学系统的最基本的光学元件，物镜目镜及聚光镜等部件均由单个和多个透镜组成。依其外形的不同，可分为凸透镜(正透镜)和凹透镜(负透镜)两大类。 当一束平行于光轴的光线通过凸透镜后相交于一点，这个点称焦点，通过交点并垂直光轴的平面，称焦平面。焦点有两个，在物方空间的焦点，称物方焦点，该处的焦平面，称物方焦平面;反之，在象方空间的焦点，称象方焦点，该处的焦平面，称象方焦平面。

5、 光线通过凹透镜后，成正立虚像，而凸透镜则成正立实像。实像可在屏幕上显现出来，而虚像不能。(三) 凸透镜的五种成象规律 1. 当物体位于透镜物方二倍焦距以外时，则在象方二倍焦距以内、焦点以外形成缩小的倒立实象; 2. 当物体位于透镜物方二倍焦距上时，则在象方二倍焦距上形成同样大小的倒立实象; 3. 当物体位于透镜物方二倍焦距以内，焦点以外时，则在象方二倍焦距以外形成放大的倒立实象; 4. 当物体位于透镜物方焦点上时，则象方不能成象; 5. 当物体位于透镜物方焦点以内时，则象方也无象的形成，而在透镜物方的同侧比物体远的位置形成放大的直立虚象。 三、 光学显微镜的成象(几何成象)原理 只有当物体对

6、人眼的张角不小于某一值时，肉眼才能区别其各个细部，该量称为目视分辨率 。在最佳条件下，即物体的照度为 5070lx 及其对比度较大时，可达到 1。为易于观测，一般将该量加大到 2，并取此为平均目镜分辨率。 物体视角的大小与该物体的长度尺寸和物体至眼睛的距离有关。有公式 y=L 距离 L 不能取得很小，因为眼睛的调节能力有一定限度，尤其是眼睛在接近调节能力的极限范围工作时，会使视力极度疲劳。对于标准(正视)而言，最佳的视距规定为 250mm(明视距离)。这意味着，在没有仪器的条件下，目视分辨率 =2的眼睛，能清楚地区分大小为 0.15mm 的物体细节。 在观测视角小于 1的物体时，必须使用放大仪

7、器。放大镜和显微镜是用于观测放置在观测人员近处应予放大的物体的。(一) 放大镜的成像原理 表面为曲面的玻璃或其他透明材料制成的光学透镜可以使物体放大成像，光路图如图 1 所示。位于物方焦点 F 以内的物 AB，其大小为 y，它被放大镜成一大小为 y的虚像 AB。放大镜的放大率 =250/f 式中 250-明视距离，单位为 mm f-放大镜焦距，单位为 mm 该放大率是指在250mm 的距离内用放大镜观察到的物体像的视角同没有放大镜观察到的物体视角的比值。 (二) 显微镜的成像原理 显微镜和放大镜起着同样的作用，就是把近处的微小物体成一放大的像，以供人眼观察。只是显微镜比放大镜可以具有更高的放大

8、率而已。 图 2 是物体被显微镜成像的原理图。图中为方便计，把物镜 L1 和目镜 L2 均以单块透镜表示。物体 AB 位于物镜前方，离开物镜的距离大于物镜的焦距，但小于两倍物镜焦距。所以，它经物镜以后，必然形成一个倒立的放大的实像 AB。 AB位于目镜的物方焦点 F2上，或者在很靠近 F2 的位置上。再经目镜放大为虚像 AB后供眼睛观察。虚像 AB的位置取决于F2 和 AB之间的距离，可以在无限远处(当 AB位于 F2 上时)，也可以在观察者的明视距离处(当 AB在图中焦点 F2 之右边时)。目镜的作用与放大镜一样。所不同的只是眼睛通过目镜所看到的不是物体本身，而是物体被物镜所成的已经放大了一

9、次的像。(三) 显微镜的重要光学技术参数 在镜检时，人们总是希望能清晰而明亮的理想图象，这就需要显微镜的各项光学技术参数达到一定的标准，并且要求在使用时，必须根据镜检的目的和实际情况来协调各参数的关系。只有这样，才能充分发挥显微镜应有的性能，得到满意的镜检效果。 显微镜的光学技术参数包括：数值孔径、分辨率、放大率、焦深、视场宽度、覆盖差、工作距离等等。这些参数并不都是越高越好，它们之间是相互联系又相互制约的，在使用时，应根据镜检的目的和实际情况来协调参数间的关系，但应以保证分辨率为准。1. 数值孔径 数值孔径简写 NA，数值孔径是物镜和聚光镜的主要技术参数，是判断两者(尤其对物镜而言)性能高低

10、的重要标志。其数值的大小，分别标刻在物镜和聚光镜的外壳上。 数值孔径(NA)是物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率(n)和孔径角(u)半数的正弦之乘积。用公式表示如下：NA=nsinu/2 孔径角又称镜口角，是物镜光轴上的物体点与物镜前透镜的有效直径所形成的角度。孔径角越大，进入物镜的光通亮就越大，它与物镜的有效直径成正比，与焦点的距离成反比。 显微镜观察时，若想增大 NA 值，孔径角是无法增大的，唯一的办法是增大介质的折射率 n 值。基于这一原理，就产生了水浸物镜和油浸物镜，因介质的折射率 n 值大于 1，NA 值就能大于 1。 数值孔径最大值为 1.4，这个数值在理论上和技术上都达到了极限

11、。目前，有用折射率高的溴萘作介质，溴萘的折射率为 1.66,所以 NA 值可大于 1.4。 这里必须指出，为了充分发挥物镜数值孔径的作用，在观察时，聚光镜的 NA 值应等于或略大于物镜的 NA 值。 数值孔径与其他技术参数有着密切的关系，它几乎决定和影响着其他各项技术参数。它与分辨率成正比，与放大率成正比，与焦深成反比，NA 值增大，视场宽度与工作距离都会相应地变小。2. 分辨率 显微镜的分辨率是指能被显微镜清晰区分的两个物点的最小间距，又称鉴别率。其计算公式是 =/NA 式中 为最小分辨距离; 为光线的波长;NA 为物镜的数值孔径。可见物镜的分辨率是由物镜的 NA 值与照明光源的波长两个因素

12、决定。NA 值越大，照明光线波长越短，则 值越小，分辨率就越高。要提高分辨率，即减小 值，可采取以下措施(1) 降低波长 值，使用短波长光源。(2) 增大介质 n 值以提高 NA 值(NA=nsinu/2)。(3) 增大孔径角 u 值以提高 NA 值。(4) 增加明暗反差。3. 放大率和有效放大率 由于经过物镜和目镜的两次放大，所以显微镜总的放大率 应该是物镜放大率 和目镜放大率 1 的乘积： =1 显然，和放大镜相比，显微镜可以具有高得多的放大率，并且通过调换不同放大率的物镜和目镜，能够方便地改变显微镜的放大率。 放大率也是显微镜的重要参数，但也不能盲目相信放大率越高越好。显微镜放大倍率的极

13、限即有效放大倍率。 分辨率和放大倍率是两个不同的但又互有联系的概念。有关系式：500NA0.65 与40X)。(5) 按校正象差的情况不同，通常分为消色差物镜，半复消色差物镜，复消色差物镜，平视场消色差物镜，平视场复消色差物镜和单色物镜。a. 消色差物镜(Achromatic objective)这是应用最广泛的一类显微物镜，外壳上常有Ach字样。它校正了轴上点的位置色差(红，蓝二色)、球差(黄绿光)和正弦差，保持了齐明条件。轴外点的象散不超过允许值(-4 属光度)，二级光谱未校正。数值孔径为 0.10.15 的低倍消色差物镜一般由两片透镜胶合在一起的双胶物镜构成。数值孔径至 0.2 的消色差

14、物镜由两组双胶透镜构成。当数值孔径增大到 0.3 时，再加入一平凸透镜，该平凸透镜决定着物镜的焦距，而其它透镜则补偿由其平面与球面产生的象差。高倍物镜的平面象差可用浸法消除。高倍消色差物镜一般均为浸式，由四部分构成：前片透镜、新月形透镜及两个双胶透镜组。b. 复消色差物镜(Apochromatic objective)这类物镜的结构复杂，透镜采用了特种玻璃或萤石等材料制作而成，物镜的外壳上标有Apo字样。它对两个色光实现了正弦条件，要求严格地校正轴上点的位置色差(红，蓝二色)、球差(红，蓝二色)和正弦差，同时要求校正二级光谱(再校正绿光的位置色差)。其倍率色差并不能完全校正，一般须用目镜补偿。

15、由于对各种象差的校正极为完善，比响应倍率的消色差物镜有更大的数值孔径，这样不仅分辨率高，象质量优而且也有更高的有效放大率。因此，复消色差物镜的性能很高，适用于高级研究镜检和显微照相。c. 半复消色差物镜(Semi apochromatic objective)半复消色差物镜又称氟石物镜，物镜的外壳上标有FL字样。在结构上透镜的数目比消色差物镜多，比复消色差物镜少，成象质量上，远较消色差物镜为好，接近于复消色差物镜。d. 平视场物镜(Plan objective )平场物镜是在物镜的透镜系统中增加一快半月形的厚透镜，以达到校正场曲的缺陷，提高视场边缘成像质量的目的。平场物镜的视场平坦，更适用于镜

16、检和显微照相。对于平视场消色差物镜，其倍率色差不大，不必用特殊目镜补偿。而平视场复消色差物镜，则必须用目镜来补偿它的倍率色差。e. 单色物镜这类物镜由石英、荧石或氟化锂制的一组单片透镜构成。只能在紫外线光谱区的个别区内使用(宽度不超过 20mm)，可见光谱区不能采用单色物镜。这类物镜均制成反射式与折反射式系统。主要缺点是相当大一部分光束在中心被遮蔽(入瞳面积的 25%)。在新型折反射系统中，由于采用半透明反射镜以及物镜的胶合结构，使这一缺点大为减轻，从而可以取消反射镜框的遮光。并且两同轴反射镜的残余象差是互相补偿的，同时用透镜组来增大数值孔径。若系统的校正满意，孔径达到 NA=1.4 时，中心遮蔽可不超过入瞳面积的 4%。f. 特种物镜所谓特种物镜是在上述物镜的基础上，专门为达到某些特定的观察效果而设计制造的。主要有以下几种：(a) 带校正环物镜(Correction collar objecti