杂种细胞的筛选和鉴定

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1、杂种细胞的筛选和鉴定利用细胞融合技术可以按照人们的意愿创造新品种和提取有用的细胞代谢产物。由于细胞间的融合率相对较低，而且不一定能得到我们预期的融合细胞，因此在实际操作中，常常用大量的细胞进行融合，一方面能够产生大量的融合细胞，可以从中分离出我们所需要的杂种细胞，从而提高实验的成功率，另一方面细胞间的融合是随机的，融合细胞的类型很多，杂种细胞的筛选和鉴定是操作流程中十分重要的环节。2003 年上海高考生物卷第 36 题，以杂交瘤细胞的筛选和杂种细胞染色体缺失为情境，考查学生对融合细胞的类型、杂种细胞筛选的原理、基因与酶的关系等方面的理解和应用。现行多个版本的现代生物科技专题教科书中，对杂种细胞

2、的筛选和鉴定这一环节都作了隐性化处理，如何处理教材的隐性化与考试的显性化这一矛盾，是目前许多教师思考的问题。本文通过杂种细胞的筛选和鉴定方法的介绍，提出相关的教学建议。1 杂种细胞的筛选方法两种亲本细胞融合的混合物中可能有多种类型细胞，如没有发生融合的亲本细胞、同核体（同源原生质体的融合体）、异核体（非同源的原生质体的融合体）、多核体（含有双亲不同比例核物质的融合体）等。1.1 利用物理特性筛选法 根据亲本的原生质体大小、颜色、漂浮密度及电泳迁移率、形成的愈伤组织的差异等特性来筛选杂种细胞。如亲本 1 用异硫氰酸荧光素（绿色）标记，亲本 2 用碱性蕊香红荧光素（红色）标记，在荧光显微镜下，就可

3、以找到杂种细胞。这种方法的缺点物理特性常常难以满足、分离工作量大、挑选出来极少数细胞不容易增殖等。1.2 营养缺陷互补筛选法 亲本双方都有营养缺陷的情况下，只有杂种细胞能在特定的条件下生存，如亲本 1 是叶绿体缺陷型，亲本 2 是光致死型，亲本 1 的细胞和同核体在培养时呈白色，亲本 2 的细胞和其同核体在光照死亡，只有杂种细胞能培养成绿色植株。1.3 选择培养基筛选法 利用原生质体对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞，如粉兰烟草与朗氏烟草细胞原生质体均需外源激素才能生长，但其杂种细胞可以产生内源激素，在培养基上不需加入植物激素，因此使用无植物激素的培养基，可以达到筛选目的。 动物细胞工程

4、中，杂交瘤细胞的筛选普遍采用的 HAT选择性培养液，在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶核苷酸。其依据的原理是细胞中的 DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（D 途径），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为 DNA 分子的合成提供原料。在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而 HAT 培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断 DNA 合成的 D 途径。另一条途径是应急途径或补救途径（S 途径），它是利用次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核苷转移酶和胸腺嘧啶核苷激酶催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。因此，在 HAT 培养液中，未融合的效应

5、 B 细胞和两个效应 B 细胞融合的 D途径被氨基喋呤阻断，虽 S 途径正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般 10d 左右死亡。对骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型细胞，因此自身没有 S 途径，且 D 途径又被氨基喋呤阻断，所以在 HAT 培养液中也不能增殖而很快死亡。惟有杂交瘤细胞，既具有效应 B 细胞的 S 途径，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此通过 HAT 培养液可筛选出杂交瘤细胞。2 杂种细胞的鉴定方法 杂种细胞的筛选过程中，必需保证杂种细胞的生理活性不受损伤，才能进行细胞培养获得新品种或细胞代谢产物。有时

6、无法直接筛选出预期的杂种细胞，可以对融合细胞进行培养甚至形成植株，再进行形态学、细胞学或分子生物学上的鉴定；有时能够筛选出杂种细胞，需要对细胞代谢产物进行鉴定。2.1 形态学鉴定 根据双亲的形态学特征进行鉴定，如叶片大小与形状，花的形状与颜色、叶脉、叶柄、花梗及表皮毛等，观察并比较组织培养产生的新植株与双亲在表现型上的差异。2.2 细胞学鉴定 利用显微镜进行细胞器分析、染色体组型分析、基因组原位杂交等鉴定杂种细胞。理论上讲如果染色体不丢失，杂种细胞中染色体数目应为双亲染色体数目之和。2.3 同功酶鉴定 同功酶是催化同一化学反应而化学组成不同的一组酶，它们彼此在氨基酸序列、底物的亲和性等方面都存

7、在着差异。同功酶的多重分子形态是特定基因的产物。杂种细胞中的同功酶谱一般是双亲酶谱之和。2.4 分子生物学鉴定 随着分子生物学的发展，人们已经找到了对杂种细胞进行鉴定、分析的更为有效的方法，如限制性片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多态性（RAPD）和扩增片段长度多态性（AFLP）等。3 相关内容的教学建议3.1 比较杂种细胞筛选和鉴定的差异 杂种细胞的筛选和鉴定是两个不同的过程，在教学过程中需要加以辨析。从时间上，杂种细胞的筛选先于杂种细胞的鉴定；从功能上，杂种细胞的筛选可以避免细胞培养的盲目性，杂种细胞的鉴定可以确认实验的成功与否；从细胞生理状态上，杂种细胞的筛选时杂种细胞生理活性不能到

8、受损伤，而杂种细胞的鉴定可以在细胞死亡后进行。3.2 理解杂交瘤细胞的两次筛选 在单克隆抗体的生产过程中，由于效应 B 淋巴细胞的特异性是不同的，经 HAT 培养液第一次筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体存在差异，必须对杂交瘤细胞群中进行第二次筛选，选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。二次筛选通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖，然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法），上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔，阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，继续进行有限稀释，一般重复 34 次，直至确信每个孔中

9、增殖的细胞为单克隆细胞。第二次筛选也是鉴定的过程。3.3 把握新授课与复习课的特点 杂种细胞的筛选和鉴定在现代生物科技专题中是隐性的，而杂种细胞的筛选和鉴定需要应用的生物学知识较复杂，虽然部分方法在必修模块的学习过程中已经涉及，但是对学生的知识的迁移能力和创新能力要求较高，超出他们现有的认知水平。普通高中生物课程标准具体的内容标准是“举例说出细胞融合与单克隆抗体”，属于了解水平的要求。因此，新授课的课堂教学的重点是植物体细胞杂交、动物细胞融合和单克隆抗体生产的过程，对杂种细胞的筛选和鉴定的意义作详细说明，而具体的方法不进行拓展，或者课堂上只进行简短的讨论，激发学生课后继续探究的热情，切不可将 2003 年上海生物高考第 36 题在新授课呈现出来，或者作为家庭作业使用。由于杂种细胞筛选和鉴定与荧光标记技术、观察染色体技术、DNA 的复制、基因与酶的关系、免疫等知识密切相关，因此，以杂种细胞的筛选和鉴定为载体，在综合复习阶段进行专题复习，从而有利于学生对相关基础知识、科学思想、科学方法的理解和运用，构建完整的知识网络，提高生物科学素养。