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1、对于 ELISA 是否能进行定量或半定量分析我一直存在疑问。我的理解如下，请高手指正：要定量分析，必须有标准品，作一个标准曲线，确定线性范围，即蛋白浓度对应吸光值的线性范围，然后在测定样品时，吸光值必须在这个范围内才能准确定量。而对于半定量，不需要标准品，因为只需得出样品蛋白浓度的相对值就可以了，但仍旧要求样品所测的吸光值在线性范围内，否则无法准确比较样品间浓度的大小。我的问题来了：如何确定此时的线性范围呢？因为此时没有标准品啊。目前，我得到了两种说法。有人说，只要 OD 值在 0.20.7 之间就可以满足线性范围的要求，还有一种说法则是 OD 值在 2 以下均可。对于这两种说法，我都没有查找
2、到文献证据来支持，均为他人口授。也许这是经验值，但我想不同的实验体系应该会有不同的线性范围吧，为了慎重起见，特将此问题拿来与丁香园的各位战友交流，请大家指教，如果能附上参考文献就最好了，谢谢！你说的半定量与我们通常所说的半定量好像有些不同吧。我们一般说的半定量其实是用“定性”的方法“定量”。因此只需阴阳性对照，而不需要定量用的标准品，也不用管线性范围。普通的定性方法只测因阳性，而半定量法，则是进行倍比稀释后测阴阳性。比如，1/2, 1/4, 1/8, .稀释后，阳性的终点为 1/8，我们根据此对样品的浓度进行大致的推断恩，楼上说得有理。不过，我说的半定量应该也是存在的吧。我理解的定量是测绝对值
3、，而半定量则是测相对值。楼上的方法固然可以比较样品间的浓度大小，但要做倍比稀释，一个样品要做 n 个稀释，比较麻烦啊。不知有没有谁做过我所说的那种半定量，有的话举个手，提供一点关于线性范围的文献资料也好啊。ELISA 有很多方法，我们经常指的半定量，跟上面一个朋友说的，不是你说的这样，比如你有一个未知血清样品，同时你要有一个对应的阴性血清，做 ELISA 后，你可以通过阴性血清，判断这个未知的样品是否是阳性。当然，不一定非要标准品，如果你能找到其他方法测定的阳性样品，你可以用这个做标准品，来确定你的样品浓度。很多试剂盒，不都需要做标准曲线，有的就两个点，提供的是标准品，或是标准样品，一样可以进
4、行半定量测定。先定性，在定量。定量不是确定到数值上。是在一个大致的范围。定性测定定性测定的结果判断是对受检标本中是否含有待测抗原或抗体作出有或 无的简单回答，分别用阳性、阴性表示。阳性 表示该标本在该测定系统中有反应。 阴性则为无反应。用定性判断法也可得到半定量结果，即用滴度来表示反应的强度，其实质仍是一个定性试验。在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。在间接法和夹心法 ELSIA 中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法 ELISA 中则相反，阴性孔呈
5、色深于阳性孔。两类反应的结果判断方法不同，分述于下。（1） 间接法和夹心法 这类反应的定性结果可以用肉眼判断。目视标本也无色或近于无色者判为阴性，显色清晰者为阳性。但在 ELSIA 中，正常人血清反应后常可出现呈色的本底，此本底的深浅因试剂的组成和实验的条件不同而异，因此实验中必须加测阴性对照。阴性对照的组成应为不含受检物的正常血清或类似物（见 3.6） 。在用肉眼判断结果时，更宜用显色深于阴性对照作为标本阳性的指标。目视法简捷明了，但颇具主观性。在条件许可下，应该用比色计测定吸光值，这样可以得到客观的数据。先读出标本（sample，S） 、阳性对照（P） 、和阴性对照（N ）的吸光值，然后进
6、行计算。计算方法有多种，大致可分为阳性判定值法和标本与阴性对照比值法两类。a 阳性判定值 阳性判定值（cut-off value）一般为阴性对照 A 值加上一个特定的常数，以此作为判断结果阳性或阴性的标准。 用此法判断结果要求实验条件十分恒定，试剂的制备必须标准化，阳性和阴性的对照品应符合一定的规格，须配用精密的仪器，并严格按规定操作。阳性判定值公式中的常数是在这特定的系统中通过对大量标本的实验检测而得到的。现举某种检测HBsAg 的试剂盒为例。试剂盒中的阴性对照品为不含 HBsAg 的复钙人血浆，阳性对照品HBsAg 的含量标明为 P=92ng/ml。每次试验设 2 个阳性对照和 3 个阴性
7、对照。测得 A 值后，先计算阴性对照 A 值的平均数（NCX）和阳性对照 A 值的平均数（PCX） ，两个平均数的差（P-N）必须大于一个特定的数值（例 0.400） ，试验才有效。3 个阴性对照 A 值均应0.5NCX，并1.5NCX，如其中之一超出此范围，则弃去，而已另两个阴性对照重新计算 NCX；如有两个阴性对照 A 值超出以上范围，则该次实验无效。阳性判定值按下式计算：阳性判定值=NCX+0.05标本 A 值阳性判定值的为阳性，小于阳性判定值的为阴性。应注意的是，式中 0.05 为该试剂盒的常数，只适合于该特定条件下，而不是对各种试剂均可通用。根据以上叙述可以看出，在这种方法中阴性对照
8、和阳性对照也起到试验的质控作用，试剂变质和操作不当均会产生试验无效 的后果。b.标本/阴性对照比值 在实验条件（包括试剂）较难保证恒定的情况下，这种判断法较为合适。在得出标本（S）和阴性对照（N）的 A 值后，计算 S/N 值。也有写作 P/N 的，这里的 P 不代表阳性(positive)，而是病人（patient）的缩写，不应误解。为避免混淆，更宜用 S/N 表示。在早期的间接法 ELISA 中，有些作者定出 S/N 为阳性标准，现多为各种测定所沿用。实际上每一测定系统应该用实验求出各自的 S/N 的阈值。更应注意的是，N 所代表的阴性对照是不含受检物质的人血清。有的试剂盒中所设阴性对照为
9、不含蛋白质或蛋白质含量较底的缓冲液，以致反应后产生的本底可能较正常人血清的本底低得多。因此，这类试剂盒规，如 N0.05（或其他数值） ，则按 0.05 计算，否则将出现假阳性结果。（2）竞争法 在竞争法 ELISA 中，阴性孔呈色深于阳性孔。阴性呈色的强度取决于反应中酶结合物的浓度和加入竞争抑制物的量，一般调节阴性对照的吸光度在 1.0-1.5 之间，此时反应最为敏感。竞争法 ELISA 不易用自视判断结果，因肉眼很难辨别弱阳性反应与阴性对照的显色差异，一般均用比色计测定，读出 S、P 和 N 的吸光值。计算方法主要也有两种，即阳性判定值法和抑制率法。a. 阳性判定值法 与间接法和夹心法中的
10、阳性判定值法基本相同，但在计算公式中引入阳性对照 A 值，现举某种检测抗 HBc 的试剂盒为例。试剂盒中的阴性对照为不含抗 HBc 的复钙人血浆，阳性对照中抗 HBc 含量为 125100u/ml。每次试验设 2 个阳性对照和 3 个阴性对照。测得 A 值后，先计算阴性对照 A 值的平均值（NCX）和阳性对照 A 值的平均数（PCX） ，两个平均数的差（N-P）必须大于一个特定的数值（例如 0.300）, 试验才有效。 3 个阴性对照 A 值均应小于 2.000，而且应0.5NCX 并1.5NCX，如其中之一超出此范围，则弃去，而以另 2 个阴性对照重新计算NCX；如有 2 个阴性对照 A 超出以上范围，则该次实验无效。阳性判定值按下式计算：阴性判定值=0.4NCX+0.6PCX标本 A 值 阳性判定值的反应为阳性，A阳性判定值的反应为阴性。b. 抑制率法 抑制率表示标本在竞争结合中标本对阴性反应显色的抑制程度，按下式计算：抑制率（%）= （阴性对照 A 值-标本 A 值）100%/阴性对照 A 值一般规定抑制率50%为阳性，50%为阴性。
