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1、1骨髓基质干细胞修复软骨缺损的实验研究【摘要 】 探寻体外诱导骨髓基质干细胞成软骨细胞的最佳细胞因子，寻求体内修复家兔软骨缺损的最为有效方案。 方法rhFGF1、rhTGF-1、rhIGF-I 单独或联合应用对骨髓基质干细胞进行体外诱导培养，应用常规染色、MTT、免疫组织化学染色的方法筛选诱导骨髓基质干细胞成软骨细胞的最佳细胞因子，并将其与骨髓基质干细胞复合于纤维蛋白凝胶制成凝胶复合物，直接种植到兔膝关节实验性关节软骨缺损处，并与对照组相比较，观察软骨修复效果。 结果常规形态学观察，rhTGF-1 和 rhIGF-I 联合应用诱导的细胞在形态上类似于软骨细胞，免疫组化染色提示诱导细胞具有软骨细
2、胞表型。凝胶复合物直接种植在体内能诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化，修复缺损的软骨，缺少细胞因子的对照组软骨缺损修复效果差。 结论rhTGF-1 和 rhIGF-I 联合应用可作为诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化的最佳组合，骨髓基质干细胞凝胶复合物能修复软骨缺损。 【关键词】 细胞因子 骨髓基质干细胞 软骨细胞 软骨缺损Abstract：ObjectiveTo retrieval a best cell factor which can induce bone marrow stromal cells (bMSCs) into 2chondrocyte in vitro and to expl
3、ore an effective plan to repair rabbits chondrocyte defect.MethodIsolated bMSCs were cultured in vitro. rh Fibroblast Growth Factor 1(rhFGF-1)、rh Transforming Growth Factor-1(rhTGF-1)、rh Insulinlike Growth Factor-(rhTGF-) were utilizated. The proliferation of cells was detected by MTT assay, and the
4、 macroscopic histology , HE staining and immunohistochemical examinations were performed to seek the best cell factor. In vivo , to investigate the repair of the articular cartilage, bMSCs combined with fibrin glue and rhTGF-1、rhIGF-I was compared with control group.ResultThe cells induced by rhTGF-
5、1 and rhIGF-I were similar to chondrocytes in morphology, and immunohistochemical examinations showed the cells possessed phenotype of chondrocytes. RhTGF-1 and rhIGF-I could differentiate bone marrow stromal cells into cartilage cells in vivo, and repair the articular cartilage defect. The control
6、group could not repair the articular cartilage defect efficiently.ConclusionrhTGF-1 and rhIGF-I are best group which stimulate bMSCs to differenate into cartilage cells. BMSCs combined with fibrin glue and rhTGF-1、rhIGF-I can repair the articular cartilage defect.3Key words：cell factor; bone marrow
7、stromal cells; chondrocyte; cartilage defect作者简介：童培建(1961-)，男，杭州人，教授，主任医师，在读博士研究生，研究方向：关节外科，(电话)0571-87070956 骨髓基质干细胞（BMSCs）中含有少量的多功能基质干细胞，能向成骨系细胞、成软骨系细胞分化1 ，为骨、软骨组织的损伤提供了潜在的修复可能。临床软骨缺损自行修复的效果较差，可能跟软骨损伤局部 BMSCs 的含量少有关。因此作者通过对 BMSCs 在体外扩增培养、应用不同的细胞因子进行诱导，从中寻找体外促进骨髓基质干细胞增殖分化的最佳条件，并将细胞因子与骨髓基质干细胞复合于纤维蛋白
8、凝胶制成凝胶复合物，植入缺损处，探讨体内修复家兔软骨缺损的效果。1 材料与方法1.1 骨髓基质干细胞的取材与培养取新生红皮胎兔只（24 h 内） ，置入浓度为 75的酒精中浸泡消毒 5 min，在超净工作台中，无菌分离四肢长骨骨干，剔除软组织，在 10的 DMEM 培养液中剖开骨干，反复吹打髓腔。将细4胞悬液移入离心管中，加入 Hanks 液至 10 ml，平衡，1 500 rmin 离心 10 min，弃上清，加入 10 DMEM，反复抽吸吹打均匀，计数，按 110接种于 ml 培养瓶中， 37 5饱和湿度培养箱中常规培养。5 d 后首次全量换液，以后每 3 d 换液 1次，待细胞融合至 8
9、0时，0.25胰蛋白酶常规消化，按 :比例传代培养。逐日倒置显微镜观察培养细胞的生长情况。1.2 体外实验分组实验分组如下：rhFGF-1 组（简称 F 组） ；rhIGF-组（简称 I组） ；rhTGF-1 组（简称 T 组） ；rhFGF-1+ rhIGF-I 组（简称 F+I组） ；rhFGF-1+ rhTGF-1 组（简称 F+T 组） ；rhIGF-I+rhTGF-1组（简称 I+T 组） ；rhFGF-1+rhIGF-I+rhTGF-1 组（简称 F+I+T组） ；对照组（不加任何试剂） 。其中 rhFGF-1 浓度为 10 g/L; rhIGF-I 浓度为 10 g/L; rhT
10、GF-1 I 浓度为 5 g/L。1.3 MTT 比色法测定取第 2 代骨髓基质干细胞以 1104/ml 接种到 96 孔培养板上，共 4 块，常规培养 24 h。待细胞完全贴壁后，弃上清液，将每块孔板随机分组，每组 8 孔，按实验分组添加相应的细胞因子，分别于第 1、3、6、9 d 各取孔板 1 块，进行 MTT 检测：即每孔加 50 5mg/ml 的 MTT 液 20 l,常规培养 4 h，弃废液，0.1%PBS 液清洗1 次，加入二甲亚砜，每孔 150 l，静置 20 min 后，用酶标仪测定波长为 490 nm 的吸光度值。1.4 体外细胞形态学观察将细胞进行 HE、胶原免疫组化测定（
11、ABC 法） ，倒置显微镜下观察。1.5 纤维蛋白凝胶复合体的制备传代培养的骨髓基质干细胞经 0.1%胰蛋白酶0.02%EDTA 消化后，1000 r/min 离心 10 min 浓集，进行细胞计数。制成单细胞悬液，与纤维蛋白原溶液混匀。使纤维蛋白原和骨髓基质干细胞的终浓度分别为 2.5 g/L 和 5106/ml，每毫升再加入 rhTGF- 15 ng/5 l 和 rhIGF-I50 ng/50 l。然后加入凝血酶 20 U/ml。制成凝胶备用（2 h 内使用） 。1.6 体内实验分组32 只家兔，雌雄不限，随机分为 4 组。无菌条件下后肢右股骨髁滑车关节面钻孔，直径 3.5 mm、深 3.
12、0 mm，达软骨下骨。干6细胞复合体组：缺损中直接种植纤维蛋白凝胶复合体；单纯凝胶复合体组：缺损植入未加细胞因子的凝胶复合体；骨髓基质干细胞注射组：缺损单纯注射浓度为 5106/ml 骨髓基质干细胞悬液 0.5 ml；空白组：缺损不作处理。不固定术肢，自由活动。分别于4、8 、12 周处死取材。标本 10福尔马林固定。行 HE、Masson三色、甲苯胺蓝染色检查。第 12 周标本行透射电镜检查。1.7 体内组织形态学评分参照 ODriscoll，Keeley and Salter 组织形态学评分标准。对实验组和对照组修复组织形态学进行半定量评分（表 2） 。1.8 统计学处理实验数据用s 表示
13、，显著性检验采用 t 检验。P0.05 为差异有显著性。使用 SPSS 11.5 统计软件进行数据统计处理。2 结 果2.1 体外细胞形态学观察贴壁细胞呈梭形、纺锤形、多角形等，有不规则的生长突生出，7细胞基质折光性强；45 d 后细胞形成集落状，形态比较单一，基本上呈梭形或多角形；78 d 后形成单层。首次传代的细胞呈圆形，24 h 后恢复梭形，折光性好，细胞呈均匀生长，形态更加单一，基本呈梭形。8 d 后可铺满瓶底，形成单层结构，排列呈有规律的方向性（图 1） 。经生长因子诱导的细胞，对照组、T 组生长速度有所减慢，10 d 左右形成单层结构；I+T 组形态由梭形变为以扇贝形或多角形为主，
14、细胞核深染（图 2） ；F 组生长加快，在 5 d 形成单层，形态以长梭形为主（图 3） 。免疫组化染色显示：细胞基质呈棕黄色，染色较均匀，证明胶原存在2 ，部分细胞不着色(图 4)。细胞经苏木素复染后可见细胞核深染，免疫组化染色后的细胞形态在镜下成圆形、椭圆形或多角形，不同于前2 代的细胞形态(图 5)。免疫组化染色（随机镜野）阳性率面积接近50%（图 4、6） 。图 1 p1 代 410 图 2 HE（I+T 组）1040 图3 HE（F 组）1020 图 4 免疫组化（I+T 组）1020 图 5 免疫组化（I+T 组）1040 图 6 免疫组化（I+T 组）10202.2 诱导细胞增殖
15、测定(MTT)第 1、3 d MSCs 细胞处于增殖静止期；细胞在第 3 d 开始进入对数增殖期，细胞增殖迅速，以 F 组增殖最为显著，第 6 d 达到高峰；第 9 d 多数实验组进入增殖平台期，增殖速度相对减缓，而I+T 组仍保持增殖的趋势（见表 1） 。MTT 测定 3 d 时各组细胞均有8不同程度的增殖；6 d 时 F 组、I 组、F+I 组、F+T 组细胞增殖较快，与对照组相比，P0.01 ，其它组细胞增殖速度不明显； 9 d 时，F 组、F+T 组、F+I+T 组与对照组相比有统计学意义（ P0.01） ；F+I 组 P0.05。表 1 生长因子在不同时间对 MSCs 的增殖活性的影
16、响注：*与对照组比较 P0.05；* 与对照组比较 P0.01；2.3 修复软骨的大体观察术后 4 周，干细胞复合体实验组标本可见缺损处由白色、半透明类软骨样组织所填充，与正常软骨组织界限清楚，表面不光滑。术后 8 周，缺损处修复组织变成乳白色，半透明光滑组织，与周围软骨组织边界开始变模糊。术后 12 周，缺损修复组织与周围正常软骨组织已基本难区分，表面平坦（图 7） 。单纯凝胶复合体组 12周缺损呈乳白色，表面平坦，边界模糊。骨髓基质干细胞注射组 12周缺损处凹陷，肉芽组织生长（图 8） 。空白组 12 周缺损处肉芽组织填充表面仍稍凹陷，与周围正常软骨组织界限仍清楚。2.4 修复软骨 HE 染色第 12 周干细胞复合体实验组的修复软骨与正常软骨整合良好，各层结构清晰，新生软骨细胞数量明显增多，排列已经类似正常软骨，潮线明显，表面未见裂缝（
