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1、鱿鱼酶解工艺条件的优化一、实验目的: 1、探索酶解鱿鱼的最佳工艺条件二、 实验原理: 以蛋白质水解度为主要指标，采用不同蛋白酶对鱿鱼蛋白质进行了水解，根据酶解效果确定适宜水解酶，以适宜水解酶组成复合酶对鱿鱼肌肉进行水解， 综合考虑温度、pH 值、酶量、酶解时间四因素，设计 L9（3 4）正交试验，以蛋白质水解度为指标，确定水解酶的最佳水解条件。蛋白质水解度按以下公式计算：蛋白质水解度=N 1/N2100%N1：水解液中氨基酸态氮含量N2：原料中粗蛋白氮含量用甲醛滴定法测得水解液中氨基酸态氮含量用凯氏定氮法测得原料中粗蛋白氮含量三、实验仪器、试剂及样品1、仪器：组织捣碎机、大容量低速离心机、电热
2、恒温水浴锅、凯氏烧瓶（500ml） 、定氮装置、2、试剂：凯氏定氮法的试剂：浓硫酸、硫酸铜、硫酸钾、400g/l 氢氧化钠溶液、40g/l 硼酸吸收液（称取 20g 硼酸溶解于 500ml 热水中，摇匀备用） 、甲基红-溴甲酚绿混合指示剂（5 份 0.2%溴甲酚绿 95%乙醇溶液与一份 0.2%甲基红乙醇溶液混合均匀） 、0.1000mol/l 盐酸溶液甲醛滴定法的试剂：40%中性甲醛溶液、1g/L 百里酚酞乙醇溶液、1g/L 中性红50%乙醇溶液、0.1mol/L 氢氧化钠标准溶液氢氧化钠溶液标定的试剂：邻苯二甲酸氢钾3、材料：鱿鱼、木瓜蛋白酶（酶活 1.5105IU/g） 、中性蛋白酶（1
3、.210 5 IU/g） 、胃蛋白酶（1.010 5IU/g） 、风味蛋白酶（510 5IU/g） 、菠萝蛋白酶（8.510 5IU/g）四、实验方法：原料预处理：冷冻鱿鱼，解冻，去内脏后采肉经切块、 ，称取 40g 经捣碎组织捣碎机后，加蒸馏水（1：1）混匀制得鱿鱼肌肉组织液，然后制得底物浓度为 4%的鱿鱼组织液。1、 （1）用凯氏定氮法测定鱿鱼组织液中的粗蛋白含量 N2准确量取鱿鱼组织液 10ml，小心移入干燥洁净的 500ml 凯氏烧瓶中，然后加入研细的硫酸铜 0.5g、硫酸钾 10g 和浓硫酸 20ml，轻轻摇匀后，安装好消化装置，于凯氏瓶口放一漏斗，并将其以 45角斜支于有小孔的石棉
4、网上。用电炉一小火加热，待内容物全部炭化，泡沫停止产生后，加大火力，保持瓶内液体沸腾，至液体变蓝绿色透明后，再继续加热微沸 30min.冷却，小心加入 200ml蒸馏水，再放冷，加入玻璃珠数粒以防蒸馏时爆沸。将凯氏烧瓶蒸馏装置如图 1 连好，塞紧瓶口，冷凝管下端插入吸收瓶液面下（瓶内预先装入 50ml，40g/l 硼酸溶液及混合指示剂 23 滴） 。放松夹子，通过漏斗加入 7080 ml，400g/l 氢氧化钠溶液，并摇动凯氏瓶，至瓶内溶液变为深蓝色，或产生黑色沉淀，再加入 100ml 蒸馏水（从漏斗中加入） ，加紧夹子，加热蒸馏，至氨全部蒸出（馏液约 250ml 即可） ，将冷凝管下端提离液
5、面，用蒸馏水冲洗管口，继续蒸馏 1min,用表面皿接几滴馏出液，以奈氏试剂检查，如无红棕色物生成，表示蒸馏完毕，即可停止加热。将上述吸收液用 0.1000mol/l 盐酸标准溶液直接滴定至由蓝色变为微红色即为终点，记录盐酸溶液的消耗量，同时做一试剂空白试验（除不加样品外，从消化开始操作完全相同）记录空白试验消耗盐酸标准溶液的体积。计算公式：粗蛋白氮的含量 N2=(（ V1-V2） c0.014)/ m 100%V1： 样 品 消 耗 硫 酸 或 盐 酸 标 准 液 的 体 积 ， ml；V2： 试 剂 空 白 消 耗 硫 酸 或 盐 酸 标 准 溶 液 的 体 积 ， ml；C： 硫 酸 或
6、盐 酸 标 准 溶 液 的 当 量 浓 度 ；m： 样 品 的 体 积 ， ml0.014： 1N 硫 酸 或 盐 酸 标 准 溶 液 1ml 相 当 于 氮 克 数 ；（2）用甲醛法测水解液的氨基态氮的含量吸取水解液 10ml 两份，分别置于 250ml 锥形瓶中，各加入 50ml 蒸馏水，其中一份加入 3 滴中性红指示剂，用 0.1mol/l 氢氧化钠标准溶液滴定至由红色变为琥珀色为终点；另外一份加入 3 滴百里酚酞指示剂及中性甲醛 20ml,摇匀，静置 1min,用 0.1mol/l 氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色为终点。分别记录两次所消耗的氢氧化钠标准溶液体积。计算公式：氨基酸态氮含量=
7、 （ （ V2- V1） c0.014） / m100%V1： 用 中 性 红 作 指 示 剂 滴 定 时 消 耗 氢 氧 化 钠 标 准 溶 液 的 体 积 ， mlV2： 用 百 里 酚 酞 作 指 示 剂 滴 定 时 消 耗 氢 氧 化 钠 标 准 溶 液 的 体 积 ， mlC： 氢 氧 化 钠 标 准 溶 液 的 浓 度 ， mol/lm： 测 定 用 样 品 溶 液 相 当 于 样 品 的 质 量 ， g0.014： 1/2N2 的 毫 摩 尔 质 量 ， g/mmol补 充 ： 标 准 氢 氧 化 钠 溶 液 在 滴 定 前 要 进 行 标 定方 法 ： 准确称取三份 0.490
8、.53 的邻苯二甲酸氢钾置于已编号的 250ml 的锥形瓶中，加 50ml 纯水，搅拌溶解。将盛有邻苯二甲酸氢钾溶液的锥形瓶内加入酚酞指示剂 1-2 滴，在碱式滴定管内注入氢氧化钠溶液至零刻度以上，赶走滴定管阀门下端的气泡，调节管内液面的位置恰好为 0.00，记下此时滴定管内液面位置的读数 V 始，然后用氢氧化钠溶液滴定。滴定至粉红色半分钟内不消失为止，即可认为到达终点，记下此时滴定管内液面位置的读数 V 末。计算公式1. C(NaOH)= m(KHC8H4O4) = m(KHC8H4O4) M(KHC8H4O4)V(NaOH) 204.22 V(NaOH)2、五种蛋白酶单酶水解效果的比较：本
9、实验在底物浓度为 4%条件下，用 30ml 鱿鱼肌肉组织液在恒温水浴锅中加热至预定温度调节至所需 pH 值,分别以木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、菠萝蛋白酶、风味蛋白酶为水解酶进行酶解，结束后移至沸水中灭酶15min,4200r/min 离心 15min,取上清液，即为水解液，测定水解液蛋白质水解度。如表 1酶种类 温度/ pH 酶解时间/h 酶解用量/ IUg-1木瓜蛋白酶 50 6.8 4 6000中性蛋白酶 50 6.8 4 6000胃蛋白酶 50 6.8 4 6000菠萝蛋白酶 50 6.8 4 6000风味蛋白酶 50 6.8 4 60003、复合酶水解效果比较把由单酶水解效果实验
10、得出最佳的三种水解酶 X1、 X2、X 3、两两组合成复合酶 X1- X2、复合酶 X1- X3、复合酶 X2- X3 分别进行复合酶水解 30ml 鱿鱼肌肉组织液，以蛋白质水解度为指标，比较水解效果，确定最佳的复合酶。各复合酶水解的条件如表格 2酶种 温度/ pH 酶解时间/h 酶解用量/ IUg-1X1- X2 50 6.8 4 3000：3000X1- X3 50 6.8 4 3000：3000X2- X3 50 6.8 4 3000：3000由实验数据得出最佳水解效果的复合酶4、复合酶水解条件的确定（1）复合酶水解正交试验用得出的最佳复合酶进行酶解 30ml 鱿鱼肌肉组织液，在底物浓度
11、为 4%条件下，综合考虑温度、pH 值、酶量、酶解时间四因素，设计 L16（4 5）正交试验，列号试验号 温度 pH 时间 酶量1 45 6 1 4 3000:30002 45 7 2 5 4000:20003 45 8 3 6 2000:40004 45 9 4 8 2000:30005 50 6 2 6 2000:30006 50 7 1 8 2000:40007 50 8 4 4 4000:20008 50 9 3 5 3000:30009 55 6 3 8 4000:200010 55 7 4 6 3000:300011 55 8 1 5 2000:300012 55 9 2 4 20
12、00:400013 60 6 4 5 2000:400014 60 7 3 4 2000:300015 60 8 2 8 3000:300016 60 9 1 6 4000:2000根据正交试验的实验数据，结合正交试验的相关知识得出复合酶水解的最佳条件（2）复合酶酶量对水解效果的影响在最佳的水解条件下，以 4%为底物浓度，用不同复合酶总量对 30ml 鱿鱼肌肉组织液水解，操作如表 4复合酶总量/ IUg-12000 3000 4000 5000 6000 7000氨基酸得率%（3）底物浓度对水解效果的影响在上述确定的条件下，改变底物浓度分别为5%、10%、15%、20%、25%、30%，用复合酶分别进行水解 30ml 鱿鱼肌肉组织液。根据各实验所测的蛋白质水解度，确定最佳底物浓度。综合以上的实验所得的实验数据得出鱿鱼酶解工艺的最佳条件。杨采凤
