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1、扬州工业职业技术学院毕业设计1第一章 绪论1.1 超氧化物歧化酶的现状研究进展超氧化物歧化酶 (Superoxide Dismutase, 简称 SOD)是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。对人体不断地补充 SOD 具有抗衰老的特殊效果。超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, EC1.15.1.1, SOD）是 1938 年 Marn 等人首次从牛红血球中分离得到超氧化物歧化酶开始算起，人们对 SOD 的研究己有七十多年的历史。 1969 年 McCord 等重新发现这种蛋白，并且发现了它们的生物活性，弄清了它催化过氧阴离子发生歧化反应的
2、性质，所以正式将其命名为超氧化物歧化酶。生物体的自由基来源有外源性和内源性两类。外源性自由基产生的主要原因是物理的或化学的因素，内源性自由基主要是由非酶反应和酶反应产生。一般来说，内源性自由基主要是指氧自由基及其活性衍生物。在正常生理情况下，机体通过自由基的产生与清除来维持一定的生理低水平的自由基浓度，这个浓度是处于动态平衡状态的，因为某些生理作用或生化反应中需要氧自由基如 O2-,-OH 等参与。但在某种病理情况下，自由基的产生与清除失去平衡，结果造成对机体的损害。氧自由基oxygen free radicals，OFR)是一类非常活跃的不稳定的代谢物，能使一些重要的生物分子包括蛋白质、类脂
3、和核酸发生改变。超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等酶能调节 OFR 的水平，一些分子比如维生素 E,A,C,K 及硒、半胱氨酸和一些混合物等也能调节它的水平。增加OFR 水平可造成这些代谢物的过表达或控制系统的损伤，从而导致诸如动脉粥样硬化、关节炎、纤维化、肺、心脏损伤、神经失调以及癌症等疾病 1。近来医学上大量研究表明人体多种疾病如癌症、心脏病、中风、肺气肿、炎症的发生、发展与恶化都涉及到氧自由基。特别是与 O2-有直接关系。而作为其清除剂的 SOD 倍加受到人们的重视。SOD 对自身免疫性疾病、放射病、肺炎、骨髓损伤，SOD 与放疗联用治疗癌均有一定效果，以上研究 SOD 都
4、来自动物血液及脏器。20 世纪 70 年代以来，国内外学者先后从豌豆、菠菜、麦胚、大豆、黄瓜、红松、小白菜等十儿种高等植物中发现有 SOD 存在，且与多种逆境有关。高浓度 SO2、O 3 持续低温与强光照都能诱发植物体内有过剩自由基的扬州工业职业技术学院毕业设计2产生,SOD 的下降。1.1.1 SOD 的种类与分布根据 活 性 中心所含金属离子的不同，SOD主要分为 CuZ n-SOD, Fe-SOD和Mn-SOD 3种 1。CuZ n-SOD主要存在于真核细胞的胞液和叶绿体中，呈现蓝绿色，相对分子量约为32 000。它由2个亚基组成，每个亚基各有1个Cu离子和1个Zn离子。 Fe-SOD和
5、Mn-SOD很相似，但是它们有明显的差异氨基酸以及对过氧化氢的敏感性。Fe-SOD多见于原核细胞及少数植物细胞中，为黄褐色，相对分子量是38 700左右。它是由2个亚基组成的，每个亚基中各含1个Fe离子。紫红色的Mn-SOD在原核生物细胞及线粒体中也比较常见，相对分子量在40 000左右。原核细胞中的Mn-SOD是由2个亚基组成，而来自真核细胞线粒体中的Mn-SOD ，是由4个亚基组成，且每个亚基各含有1个Mn离子。3种SOD在许多方面都有不同点，见表1。90年代，人们又陆续从链霉菌属中发现了Ni-SOD和FeZ n-SOD ，在牛肝中发现了一种Co- Z n-SOD等不同的SOD，这些都是少
6、见的SOD 2。表 1 3种常见的叙化物歧化酶(SOD)的比较项目 CuZ n-SOD Fe-SOD Mn-SOD主要存在部位 真核细胞的细胞质 原核细胞及 原核细胞和和叶绿体的基质中 少数植物中 真核细胞线粒体中颜 色 蓝绿色 黄褐色 紫红色亚基种类及数量 2或4个相同的亚基 2或4个相同的亚基 2或4个相同的亚基亚基相对分子量 16 000 23 000 23 000扬州工业职业技术学院毕业设计31.1.2 SOD 的结构19 75 年 Richardson得到了Cu.Zn-SOD的三维结构Cal，发现它是由2个基本相似的亚基组成的二聚体，且每个亚基含有1个铜原子和1个锌原子。2个相同亚基
7、之间通过非共价键的疏水相互作用而缔合，类似于圆筒的端面。CuZn-SOD的单个亚基活性中心结构 3见图1。从图中可知Cu与4个来自组氨酸残基(His44，46， 61，118) 的咪哇氮配位呈现1个三角双锥畸变的四方锥构型,Zn则与3个来自组氨酸残基 (His61，69，78)的咪哇氮和1个天门冬氨酸残基(Asp81)的梭基氧配位，呈畸变的四面体构型。Mn - SO D和Fe- SOD 的结构则比较简单，且二者相似，每个亚基的活性中心金属离子，都是与1个水分子和3个组氨酸(His)残基及1个天门冬氨酸(Asp)残基的梭基氧配位，呈畸变四方锥构型, Mn-SOD和Fe-SOD一般为二聚体或四聚体
8、，每个亚基含0. 5-1. 0个Mn和Fe原子.它们在空间结构上与 CuZn-SOD不同，含有较高程度的。一螺旋，而P-折叠较少。现已有多种生物中的SOD的三维结构登录到GenBank中，并且对其内部结构特征进行了分析。目前，通过X-射线衍射分析、光谱分析、核磁共振谱、电了光谱，及电镜等多种近代分析方法和研究手段，获得了不少有关SOD活性中心的分子结构信息。Cu/Zn-SOD酶由两个亚基组成，每个亚基各含一个 Cu2+和一个Zn 2+, Zn2+和Cu2+都处于四面体配位环境中，Cu 2+位于一扭曲的四方平面中，分别和 44位、图 1，C uZn-SOD 的 单 个 亚 基 活 性 中 心 结
9、 构扬州工业职业技术学院毕业设计446位、61位和118位的组氨酸形成配位键，Cu 2+和Zn 2+之间共连1个组氨酸H61的咪唑基形成含咪唑桥的扩展结构铜和锌的配位情况见图1-2；Mn-SOD和Fe-SOD各只含一个亚基，锰离子处在三角双锥的配位环境中，其中一个轴向配体为H2O，另一个轴向位置为蛋白质辅基的配位基; Fe-SOD的活性中心是由3个His-Im-N和1个天冬氨酸羧氧基成扭曲四面体配位图 2 铜和锌的配位图1.1.3 SOD 的催化机理超氧化物歧化酶作用的底物是超氧阴离子自由基(O -2) ,它既带一个负电荷,又只有一个未成对的电子。在不同条件下, O -2 既可作还原剂变成 O
10、2 ,又可作氧化剂变成H 2O2 ,H2O2又在过氧化氢酶( Catalase ,CAT) 的作用下,生成H 2O 和O 2 ,由此可见,有毒性的O -2 在SOD 和CAT共同作用下,变成了无毒的H 2O 和O 2 。其作用机理如下 4:第一步 22CuEOCuE第二步 22 OHH221.1.4 SOD 的活力测定SOD的活力测定方法很多，常见的有化学法、免疫法和等电点聚焦法。其中化学法应用最普遍，化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和O2 -，利用SOD分解而间接推算酶活力。在化学方法中，最扬州工业职业技术学院毕业设计5常用的有黄嘌呤氧化酶法，邻苯三酚法，化学发
11、光法，肾上腺素法，NBT-还原法，光化学扩增法，Cyte还原法等。其中改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。化学发光法和光化学扩增法不适用于测定Mn-SOD，但对于Cu/Zn-SOD反应极灵敏。Cyte还原法用于Mn-SOD活力测定结果稳定，重复性好。但专一性和灵敏度不够理想，而且需要特殊仪器，实际应用受到限制。亚硝酸盐形成法与CN抑制剂或SDS 处理相结合，应用于Mn-SOD 测定，灵敏度比Cyte还原法提高数倍，而且专一性强，重复性好，操作方便，不需要特殊仪器和设备，易于实际应用和推广，是目前较好的测定方法之一 1。 在一般情况下，SOD 酶活性测定只能应用间接活性测定法。本实验采用邻苯
12、三酚自氧化方法。 1.2 SOD的理化性质SOD 是一种酸性蛋白，在酶分子上共价连结金属辅基，因此它对热，pH以及某些理化性质表现出异常的稳定性，SOD 的主要理化性质见表 1-1。表 2 SOD 的某些理化性质 6Cu/Zn-SOD Mn-SOD Mn-SOD Fe-SOD分子量 32,000 44,000 80,000 40,000含有金属数 2 Cu，2 Zn 2Mn 4 Mn 2Fe紫外线 258 280 280 280nm最大光吸收/nm 可见光 680 475 475 350氨基酸组成特点酪氨酸和色氨酸缺乏含酪氨酸和色氨酸含酪氨酸和色氨酸含酪氨酸和色氨酸1mol/LKCN 抑制 明
13、显抑制 无 无 无H2O2 处理 明显失活 无影响 无影响 明显失活SOD 是金属酶，用电子顺磁共振测得，每 mol 酶含 1. 93 mol 的 Cu 和 1. 8 mol 的 Zn(牛血 SOD)；1. 84mo1Cu 和 1. 76mo1Zn(牛心 SOD)。实验表明，Cu与 Zn 的作用是不同的，Cu 与催化活性有关，透析去除 Cu 则酶活性全部丧失，一旦贡新加入，其活性又可重新恢复；而 Zn 对维持酶分子结构的完整性有着重要的作用。有实验表明:在 Cu/Zn- SOD 中，一旦与 Zn 结合的组氨酸和天冬氨类型理 化 性质扬州工业职业技术学院毕业设计6酸被丙氨酸取代，则酶的折叠结构及
14、完整性遭到破坏。在 Mn 和 Fe- SOD 中，Mn 和 Fe 与 Cu 一样，对酶活性是必需的 6。1.2.1 SOD的亲水性SOD 是能在水中有较好溶解性能的蛋白质，结构已研究较多的牛红细胞Cu/Zn-SOD 中，已知 310 个氨基酸残基，其中 30%是极性氨基酸，仅有 3%左右的芳香族氨基酸残基，因此决定其具有较好的溶解性能。1.2.2 歧化反应速度在 Cu/Zn- SOD 催化下歧化反应的速率常数大约为 1.8109（mol/L） -1S-1，而且在 pH5. 3-10. 5 范围内几乎不变。在 pH7. 0 时，M n- SOD 与 Cu/Zn- SOD催化速率常数一样，但在碱性
15、条件下明显减小(pH=7.8 时，k=1.8109（ mol/L） -1S-1，pH= 10. 2 时，k=0.310 9（mol/L） -1S-1)。而也有不同实验表明：Mn- SOD 有较宽的最适 pH 范围( pH7- 11)。Fe- SOD 在高 pH 下活性降低 17。1.2.3 温度对SOD的影响Cu/Zn- SOD 对热稳定，天然牛血 Cu/Zn-SOD 在 75下加热数分钟，其酶活性丧失很少。在离子强度很低的情况下，加热至 95 0C, Cu/Zn- SOD 的活性损失亦很少，构象熔点温度 Tm 的测定表明是迄今发现热稳定性最高的球蛋白之一。而 Mn-SOD 对热比较敏感。1.
16、2.4 pH对SOD的影响酶活性受 pH 值的影响，这是人所共知的理论，对 SOD 来说，pH 值改变将会改变酶蛋白金属辅因子的结合状态，而影响其活性。一般认为 SOD 在pH5.3-9.5 范围内，其稳定胜较好，对 pH 不甚敏感。SalimML 等报道 Cu/Zn-SOD 在 pH5.3-9.5 范围内基本稳定，在此范围内可见紫外光谱和电子自旋共振波几乎不发生改变，显示了较强的结构稳定性。李泽浩报道在 pH 为 3.6 时，Cu/Zn-SOD 中 95%的 Zn2+离子要被脱落，在 pH 小于 6.0 时，Cu 2+的结合位点仅要移动，pH 大于 12.2 时，酶的构象会发生变化而失活。据有关材
