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1、 山西医科大学本科生毕业论文论文题目：煤工尘肺患者血清 HMGB1 与尘肺期别的关系探讨学生姓名 秦超西 学 号 2007103063 指导教师 李素平教授 学科专业 预防医学 班 级 30703 二一二年六月目录目 录1中文摘要2英文摘要2前言3材料与方法4结果5讨论6参考文献7致谢9煤工尘肺患者血清 HMGB1 与尘肺期别的关系探讨【摘要】 目的 研究煤工尘肺患者血清中 HMGB1 与尘肺期别的关系，从人群的角度为煤工尘肺的早期防治、诊断和治疗提供依据。方法 选择西山煤矿总医院职业病科就诊病人作为人群试验对象，采集血清，采用酶联免疫吸附的方法测量 HMGB1 的表达，使用 SPSS 软件对
2、结果进行分析。结果 煤工尘肺患者血清中HMGBl 的平均浓度在 0 到期，随尘肺的进展逐渐升高，各期之间有明显的统计学意义；当尘肺发展到期时，HMGB1 降低，与期比较，显示了统计学差异。结论 HMGBl 可能密切参与了煤工尘肺肺纤维化的病理过程，HMGBl 对煤工尘肺的早期诊断和治疗具有提示意义。【关键词】HMGB1；煤工尘肺。【 Abstract】 Objective To study relationship of coal workers pneumoconiosis patients with serum HMGB1 and lung function， explore HMGB1
3、on pulmonary function in damage, and provide a theoretical basis for early prevention and treatment of coal silicosis.Methods To select the patients of Xishan Coal General Hospital Occupational Medicine treatment as Collection object of population test.Results The pneumoconiosis staging is closely w
4、ith the HMGBl average concentration in the serum of patients with coal workers pneumoconiosisConclusion HMGBl may be involved in the pathological process of pneumoconiosis pulmonary fibrosis,Phase II of pneumoconiosis is the main period of HMGBl involved in the pathological process of pneumoconiosis
5、 pulmonary fibrosis【 Key words】 HMGB1; Pneumoconiosis 前言尘肺病是我国分布最广泛、最常见、危害最严重、发病最多的职业病之一。据卫生部统计，2010 年全国内地 3O 个省、自治区、直辖市（不包括西藏)和新疆生产建设兵团报告职业病例是 2000 年报告病例的 13 倍；其中尘肺病例与2009 年相比增加了 643，是 2000 年报告病例的 16 倍 1。我国每年新增尘肺病病例一万例上，其中煤炭行业尘肺病病例约占全国尘肺病患者总数的50。煤炭行业由尘肺病引发的矿工伤亡人数，远远高于各类工伤事故伤亡人数的总和 2。但尘肺病目前是一个没有医疗终结
6、的致残性职业病，临床尚无特效药物治疗，主要以对症治疗，缓解病情为治疗手段，其主要原因是对尘肺发病机理认识不足，使开发和研制治疗尘肺的药物受到限制。所以说，尘肺病仍是我国一个重大的公共卫生和社会问题，防治工作还很严峻。尘肺病是由于在职业活动中长期吸入生产性粉尘并在肺内潴留而引起的以肺组织弥漫性纤维化为主的全身性疾病。 随着对肺纤维化发生机制研究的不断深入,大量研究结果证实细胞因子在肺纤维化发生发展中起关键作用。细胞因子通过自分泌或旁分泌方式发挥其生物学作用,通过与其靶细胞表面相应受体相互作用将生物信号转导至细胞内,启动胞内信号转导级联,调控胞内基因表达,而致肺纤维化。如，Huaux 等 3 发现
7、二氧化硅粉尘诱导的纤维化小鼠模型中型细胞因子 IL-4、IL-10 和 TGF- 活性增加,在敲除 IL-10 的同组大鼠模型中,由二氧化硅粉尘诱导的纤维化程度明显减弱,提示型细胞因子在肺纤维化的发展中起了重要作用 4。另一项研究发现将 TGF- 基因转入大鼠体内,使其过度表达 TGF-,可导致纤维生成,且 TGF- 的表达量与纤维化程度呈剂量-反应关系 5。 Davis 等 6研究发现,在肺纤维化动物模型的肺泡灌洗液、肺组织纤维化病灶中均发现类细胞因子 IFN-的 mRNA 水平和蛋白表达增加。细胞因子和肺纤维化关系的机制研究已取得了一些进展,肺纤维化细胞因子假说已初步形成,在临床治疗肺纤维
8、化疾病方面也取得了初步成果。但仍有许多领域需要进一步研究,如细胞因子 HMGB1 在尘肺纤维化中的作用和机制研究不多。HMGBI 最早由 Goodwin 描述为一种非组蛋白，具有高电泳迁移率。该蛋白基因定位于人染色体 12q12 带，在哺乳动物中是一个高度保守的序列。结构由3 部分组成：1 个负电荷的羧基端，2 个同源的 DNA 结合基序 A box 和 B box，每个由大约 80 个氨基酸残基组成。空间构象是由 3 个 11 螺旋组成特征性的“L型结构 7。它与 DNA 结合可稳定核小体形状，作为基因和组织特异性的转录调控因子有调节转录活性的作用。早期对 HMGBl 的研究集中在它作为 D
9、NA 结合蛋白的作用上。近年来被认为是一种重要的晚期炎症因子，它作为晚期炎症介质在动物和人类的内毒素血症，败血症，失血性休克中发挥作用 8。用 HMGBl 的拮抗剂特异性地抑制内源性的HMGB I 能降低败血症的病死率。目前认为：HMGBl 通过两种途径释放到细胞外；一种是被动的过程，亦即从坏死的细胞中弥散出来；另一种是主动的过程，由活化的单核巨噬细胞主动释放。基于 HMGB34367 与 HMGBl 分子是同一家族成员的产物 9， 并且 HMGBl 不仅能被损伤的细胞被动释放，还能被激活的单核巨噬细胞主动分泌，被释放到细胞外的 HMGBl 能够通过受体依赖的信号转导通路产生进一步的免疫炎症及
10、损伤放大效应，故而被称之为“nuclear weapon in the immune arsenal”(免疫系统的核武器) 10。因此我们推测，HMGBl 可能在尘肺病理过程中是链接反复炎症损伤和异常修复闭式坏路之间的关键分子。但与尘肺组织纤维化的发生发展关系尚不明确。本研究选择西山煤矿总医院职业病科就诊病人作为人群试验对象，采用免疫组织化学方法检测 HMGB1 蛋白在煤工尘肺患者血清中的表达情况，探讨 HMGBl 为煤工尘肺的早期诊断和治疗提供依据的可能性。材料与方法1.1 样品采集选择西山煤矿总医院职业病科就诊病人作为人群试验对象，采集血液。用干净的试管收集血液，室温凝固 2 小时或 4
11、oC 过夜，4 oC 离心 1000 转 10 分钟，收集血清。立即分析或分装后20 oC 冷冻保存。样品如果不立即分析，应分装后冷冻保存，且避免反复冻融。1.2 实验仪器（1）酶标仪 Molecular Devices Spectra Max M50 China Technical Support；（2）超纯水仪 NW Ultra-pure water system Heal Force； （3）电子天平 AB104-N Mettler Toledo Group 生产；（ 4）离心沉淀机 LXJII 上海医用分析仪器厂；（5）TU-1800 紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；
12、（6）美菱 BCD-228 冰柜 安徽美菱有限责任公司；（7）旷场分析箱 自制。1.3 实验方法（1）确定本次检测所需酶的已包被抗体的酶标板孔数目 11。（2）将倍比稀释的标准品各 0.1ml 依次加入一排 7 孔中，1 孔只加样品稀释液的作为对照。处理后的标本按 100ul 每孔加入。（3）酶标板加上盖，37 oC 反应 90 分钟。（4）反应后手工洗板：吸去或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将 TBS 洗涤缓冲液至少 0.35ml 注入孔内，浸泡 1-2 分钟。根据需要，重复此过程数次。（5）将准备好的生物素抗体工作液按每孔 0.1ml 依次加入。37
13、oC 反应 60 分钟。（6）0.01M TBS 洗涤 3 次，每次浸泡 1 分钟左右。（7）将准备好的 ABC 工作液按每孔 0.1ml 依次加入，37 oC 反应 30 分钟。（8）0.01M TBS 洗涤 5 次，每次浸泡 1-2 分钟左右。（9）按每孔 0.1ml 依次加入 TMB 显色工作液，37 oC 避光反应，反应过程中，要经常的观察，当肉眼可见标准品的前 3-4 孔有明显的梯度蓝色，后 3-4 孔差别不明显时，即可加入 TMB 终止液 0.1ml/孔。 （显色反应最长不要超过30 分钟） 。（10）用酶标仪在 450nm 测定 O.D.值。（11）根据样品的吸光值在坐标上找出对
14、应的浓度。用户也可以使用各种应用软件来计算。应记住由于样品稀释了 N 倍，其实际浓度应该N。14 数据处理采用平均值标准差( )记录统计数据,应用 SPSS17.0 软件进行单因素sx方差分析(One-Way ANOVA)，应用 Excel 2003 软件制作柱状图。实验结果2.1 实验结果表 1 不同期别血清 HMBGB1 的水平*期与 0 期相比 p0.01 *期与期相比 p0.01 *期与期相比 p0.01表 1 显示：期尘肺与 0 期尘肺,期尘肺与期尘肺，期尘肺与期尘肺结果比较，尘肺患者血清 HMGB1 平均浓度差别均有有统计学意义(P001)。此结果表明煤工尘肺患者血清中的 HMGB
15、l 平均浓度与尘肺的分期紧密相关。 表 2 尘肺期别与 HMGB1 平均浓度直方图*期与 0 期相比 p0.01 *期与期相比 p0.01 *期与期相比 p0.01表 2 显示：煤工尘肺患者各期血清 HMGB1 平均浓度均有不同程度的升高，但期尘肺患者血清 HMGB1 平均浓度的升高幅度更大。此结果表明煤工尘肺患者血清中 HMGBl 的平均浓度在 0 期到期，随尘肺的进展逐渐升高；当尘肺发展到期时，HMGB1 降低，与期比较，显示了统计学差异。讨论研究表明，损伤和坏死的细胞能被动释放 HMGBl，活化的单核巨噬细胞能够主动分泌 HMGBl。HMGBl 通过内分泌和旁分泌的形式作用于单核细胞、内皮细胞等多种细胞，引起一列炎症因子、黏附分子释放，导致细
