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1、一种血型凝集检测的集成光纤微流控装置Melur K. Ramasubramanian & Stewart P. Alexander摘要：在本文中，描述了一种关于血型交叉匹配凝集反应检测的集成光纤微流控芯片装置。这个装置主要组成是由在注射泵的作用下把发生反应的红细胞悬浮液注入到一条直微流控沟道。这些液体与光纤交叉配对所产生的光学路径被发射器接收并集成到微流控装置中。一个波长为 650nm 的激光二级管作为光源，一个硅光电二极管用来检测光强。两根光纤末端的间隔可以进行调节。当光纤之间的间距过大和悬浮液的浓度过高时，散射现象将作为凝集检测的主要原理。而当浓度低和间隔小时，光电断路现象将成为主要检测原
2、理。通过数据计算出凝集强度因子。在对各种血型的研究表明，遥感方法能够正确识别各种情况下的凝集反应。将来临床输血前的检查实施方法可以用一种一次性的集成装置设计出来。关键词： 红细胞；凝集反应；输血；交叉匹配；散射；微流控芯片；光纤；光电断路；血型1 简介不法输血的主要原因是人为错误。涉及ABO血型的事件（以A型、B型、O型为分组）通过失败的组织和管理在测试过程和分析中可能会出现不兼容性，有很大一部分的这类错误发生在临床。对病人错误的输血管理仍是产生急性溶血性输血反应的主要原因，其中经常出现在对病人的错误辨识。它还表明，执行临床兼容测试的可靠性是由培训者的培训和经验为主要决定因素。最终的交叉匹配和
3、兼容性测试是作为一个故障保护机制用来防御可能出现在输血过程中的任何时间的潜在的致命性输血错误，并已用了半个多世纪。在法国，自1965年以来临床输血兼容测试（PBCT）是法定存在的。虽然它广泛强调在输血过程的每个阶段都必须有严格的安全预防措施，对于临床测试套件的改善一直主张要使过程方便简洁和提高凝集反应的检测，包括自动化技术。交叉匹配自动化装置的发展能消除在过程和主观问题解读中出现的错误，以及消除病人对主要的ABO血型不相容的错误辨识的风险，并且大大提高了输血的安全性。当前为高容量使用而设计的血型自动化装备是复杂而且昂贵的机械装置，并且在一个集中的实验室环境中使用。最近，一种为客观量化红细胞的紫
4、外光和可见光分光光度法被提出来了。在这种方法中，血型组的确定是通过比较光谱密度在665nm到1000nm而获得。在数据的基础上，计算出了一种比较有价值的数据，称之为凝集指数（AI）。 AI值较小表明没有凝集反应发生，而较高的AI值则表明凝集反应很强烈。这种方法需要使用分光光度计并且需要足够专业的人员进行数据采集并计算出凝集指数。不管怎样这种方法还是非常有希望和潜力使临床病人输血测试实现自动化和简洁化。一种简化的传感器装置已经通过设计和实验验证了它的可行性，通过不断的对光纤交替设计的尝试进一步简化了该装置。这种简化传感器的设计已与分光光度法的步骤一样完整。分光光度法设计最重要的方面仍然是仔细确保
5、样品通过稀释。在传感器构造中必须要使光学透镜小心地按要求对准。通过对光纤集成和信号调节的进一步小型化使得这种传感器电子产品的设计成为可能，但是可能会很复杂。按照血细胞的凝集程度的大小规模设计测试装置，凝集反应的效果将会被放大并能够轻松检测出来。在本文中，我们设计了一种简单的光纤微流控集成装置通过凝集细胞的规模和大小来检测凝集反应。图一 微流控凝集装置示意图图二 微流控芯片装置图1.1 背景为了设计这个传感器，对血液的生理学的理解非常重要。这里给出一个简短的概括。红细胞数量占总血量的40-50%左右。人体的红细胞是双凹的球体，它的平均直径为7.5m，边缘图4 凝集传感器装置图3 光电二极管放大电
6、路厚度为2.4m，中心厚度为1m。红细胞的主要组成成分是血红蛋白，它占细胞总重量的90% 。血型是红细胞表面抗原类中的一种，并且随后血浆中包含的抗体取决于对应的红细胞中的哪种血型抗原和对应的血浆中的哪种互补抗体。存在在红细胞中的A型抗原被定义为A型血；存在红细胞中的B型抗原被定义为B型血；而红细胞中同时存在A、B型抗原的定义为AB型血；红细胞中没有A型和B型抗原的定义为O型血。对于血型组ABO(A型、B型、O型)就是病人红细胞抗体（抗体A或抗体B）试剂的混合配制成的，而另一个血型组是由血浆中试剂细胞的混合配制的。而Rh因子的分类是另一种重要的血型系统。按照红细胞中是否存在Rh抗原而分类。如果有
7、Rh 抗原那么就是Rh阳性，如果没有Rh 抗原那么是Rh 阴性。Rh型血的定义来源于确定恒河猴体内是否存在Rh抗原的基本测试。抗体D被用来检测Rh 因子。因此当用ABO系统和Rh系统进行血型测试时，对结果进行组合，叫做ABO阳性和ABO阴性。2 装置设计当凝集的红细胞悬浮液稀释后流向一条面积算的上足够狭窄的通道时，凝集细胞能够阻碍或者破坏光线的对准。如果通道较宽且光束直径较大，那么在光路中那些细胞将会引发可测量的向前分散现象，测量向前分散强度和它的依赖波长可以作为确定凝集反应程度的方法。在本文中，我们提出了一种集成的光纤微流控装置用来检测凝集反应。整体设计思路如图1所示。在注射泵的作用下，发生
8、反应的红细胞悬浮液被抽到微流控沟道中。将一条合适的光纤插入到与微流控沟道中液体流动垂直的方向，并用激光通过光纤发射出来。而在光纤端口相反的另一端直接接上光源，另一光纤放置在穿过沟道并且由光电二级管探测器直接接收。光纤两个末端端口的间距可以调节。从光电二级管接收到的光强通过信号调节电路被记录成电压。这个电压和接收到的光强成正比，为使光纤间距比较紧密，小颗粒（单个红细胞）通过的光路会变得微弱或者消失而光强几乎是常数或者相对于平均值有较小的波动。当凝集颗粒穿过光路时它们会引起光线的大幅度消失，因此通过的测量的光强和电压信号也会显著下降。图5 步骤1的集成光纤微流控沟道。光纤间距为50m3 材料和方法
9、3.1 微流控芯片光纤微流控装置分成两个步骤构建而成。第一步，用适当的绘图程序绘出微流控沟道（例如Adobe Illustrator），并且用一台喷墨打印机在透明的薄膜上打印出一张高分辨率（3556DPI）的图片。微通道清晰的出现在通明薄膜上并且定位在路径3，黑圈的直径和路径3正好相对应。硅晶片，用来遮住打印出来的透明薄膜。制作微流控模型时硅晶片是用来当做光滑的背衬。路径3，硅晶片连接到劳瑞尔光致抗蚀剂涂料器的旋转卡盘上，为实现所需要的厚度，在晶片和转盘上涂上少量的光固化环氧树脂胶（SU-8胶）。薄膜的厚度将会是完成微流控装置所需要的沟道深度。一旦SU-8胶膜片成型，那么掩盖在顶部的SU-8胶
10、层将会在紫图6 样本的生理盐水溶液，AB型阳性装置1。(a) 光电二极管输出 . (b) 信号柱状图外线下发生曝光。这是为了固化一部分暴露在外面的SU-8胶也就是沟道侧面和金属薄片其余未处理的部分。所有的没反应的SU-8胶部分都要被冲洗掉，只留下硅晶片上所需要的部分，将晶片上的模型通过150的烘烤使它硬化，经过120分钟后，模具就形成了。184硅酮树脂胶基础弹性体也是用来制作微流控装备的，这种弹性体浇在位于浅盘底部的SU-8胶膜片上，184硅酮橡胶固化剂是用来固化装置的，硅酮胶就这样在SU-8胶膜片上成型。一旦硅酮胶成型就固化在SU-8胶膜片上，将它剥落后就会粘附在玻璃平板上形成流体通道。图2
11、显示了这项研究的微流控装置的构造图，这两个交叉通道分别是250m宽和125m深。在图形的顶部可以看到一个硅胶孔，是通过泵把流体注入设备中用的。图7 对照样本，AB型阳性装置1(a) 光电二级管输出. (b) 信号柱状图图8 A抗体样本，AB型阳性装置1 (a) 光电二极管输出 (b) 信号柱状图为了方便处理将装置固定在铝板上，并把它牢固的夹在带有弹性滑片的显微镜台座的夹座上。将显微镜放在它的侧面，这样流体通道就是垂直的。这只不过是为了调整显微镜目镜使得镜片和视频摄像机更容易的对接从而记录下影像。相机用三脚架固定住，并且靠近装置中水平放置的目镜。此后，流体通过注射泵的压力驱动，显微镜的倾斜对结果
12、不会产生任何影响。一根管道插入到洞孔进入到微通道而管道的另一端插入到注射泵中。流体样品通过注射泵以每分钟0.5L的比例注入到装置的每个部位。3.2 光纤垂直通道被用来流体的流通，水平交叉管道被用来引入检测和测量凝集反应结果的光纤。我们用了两种不同的多模、低氧化、可见的红外光纤，并用一根康宁SMF-28e的单模光纤进行两种不同的配置。第一种组合是把康宁SMF-28e光纤作为源光纤，而AFS 50/125光纤作为接收光纤。第二种组合是把AFS50/125光纤既作为源光纤也作为接收光纤。对于波长为630nm的光源，AFS50/105Y 和AFS105/125Y光纤的传输速度规定为99.99%/m，对
13、于康宁SMD-28e光纤的衰减为0.05dB/Km，在我们设计中，距离设计的很短，对所有的光纤而言衰减可以忽略不计的。AFS光纤由石英晶体熔合，直径是50m或105微米，包层直径为125m，丙烯酸脂涂层直径为250m。而康宁SMD-28e光纤的纤芯直径为8.2m，包层直径为125m，涂层直径为245m。然而康宁单模光纤的截止波长为1260nm，而模场直径大约为9.2nm的光纤的截止波长在1310nm。用光源波长为650nm的光源通过激光二极管照射光 纤上，那么单模光纤(SMF28-e)图9 B抗体样本，AB型阳性装置 1 (a) 光电二极管输出 (b) 信号柱状图图10 D抗体样本，AB型阳性
14、装置1 (a) 光电二级管输出 (b) 信号柱状图可以转换成多模光纤，进一步发生色散的附加多模光纤在这些条件下变得更加有活性，但是在这个程序中它不受关注，由于光纤纤芯的尺寸问题，它的模场直径比其他两根光纤更小，因此在本文中，它是用来构建更窄的光束。将光纤的涂层或者外层完整的去除掉，使得引入到流体通道的所有三根光纤的外层直径都是125m。沟道的宽带是250m、深度为125m。将剩余的光纤插入到水平的流体通道中防止流体泄露。在显微镜下，通过对光纤间距的调整使得光纤完全对齐。对三种不同的装置进行评估，装置1和装置2使用的第一种光纤组合（SMD-28光纤作为源光纤，AFS 50/150Y作为检测光纤）
15、，而装置三是用的第二种光纤组合（AFS105/105Y既用来作为源光纤也用来作为检测光纤）。装置1的微流控沟道中光纤的间距是50m，而在装置2中的间距是25微米。装置3中的光纤间距就是完整的沟道宽度，即为250m。3.3 激光光源我们通常用廉价而且具有代表性的classA激光二极管用来做为一个红色激光指针。波长大约是650nm（激光指针激光二极管的指定波长是从610nm到670nm），最大输出功率为5mW。二极管通过一根小的毛细铝管和光纤末端进行耦合，并用黑胶带进行固定。在这个过程中会产生耦合损失，但在整个装置中都是一个恒量，对结果不产生影响。3.4 电子接收器接收器是由一个硅光电二级管（Ha
16、mamatsu S1226-18BK）和一个信号调节电路组成。这种光电二级管专门把紫外可见区域设计为720nm，从而抑制红外光灵敏度达到最大。信号调节电路如图3所示。AD549是当前一种超低偏置的电流输入运算放大器，OP7是一种超低补偿电压运算放大器。R是反馈电阻，并且设置在5G。为了消除外部的电池干扰(EMI)，将整个电路安置在一个由电池组供电的金属容器内。输入的光通过一个小孔从光电二极管的端口传输到微流控装置的光纤中并进入金属场。输出信号线通过一个小孔传输到金属屏蔽盒的数据分析系统。这种屏蔽作用是重要的而且必要，因为一个5G的电阻只能用在R 上。电路中的噪声在没有屏幕作用的情况下从几V降到5mV的有效值，几乎和有屏蔽作用的情况下相差三个数量级。图11 装置2 光纤间距为25m由于系统的非常微弱的光信号以至于需要进行这样的大型放大处理。虽然通过选择大功率的激光二极管可以增加输入功率。这项工作的目标就是运用简单现成的部件使得功率需求变得更低以
