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1、1发育生物学实验指导2008-2009 学年第二学期2009 年 4 月 2 日2实验一1 原理 卵巢表面为单层立方或扁平的表面上皮，上皮下方为薄层致密结缔组织构成的白膜。卵巢实质分为皮质和髓质。皮质含不同发育阶段的卵泡、黄体和白体，卵泡间结缔组织由低分化的梭形的基质细胞、网状纤维及散在的平滑肌纤维构成。髓质有血管和淋巴管。近卵巢门处有少量门细胞，其结构和功能类似睾丸间质细胞，可分泌雄激素，在 FSH 和 LH 刺激下，每个周期有一批卵泡发育，其中之一发育成熟并排卵。卵泡的发育分为原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡四个阶段。原始卵泡体积小，由一个初级卵母细胞和一层扁平的卵泡细胞构成。初级卵
2、母细胞为圆形，直径约 40m，核大而圆，染色浅，核仁明显，胞质嗜酸性。初级卵母细胞是在胚胎时期由卵原细胞分裂分化形成，并停滞在第一次减数分裂前期，直至排卵前才完成分裂。初级卵泡为原始卵泡在 FSH 的作用下发育形成。初级卵母细胞增大，在靠近质膜的胞质中出现电子致密的溶酶体，称皮质颗粒。卵泡细胞增生，由扁平变为立方形或柱状，由单层变为多层；最内一层卵泡细胞为柱状，呈放射状排列，称放射冠。在初级卵母细胞与放射冠的卵泡细胞之间出现一层均质状、嗜酸性的透明带。构成透明带的蛋白中，ZP3 为精子受体。次级卵泡 其内出现卵泡腔，腔内充满卵泡液；初级卵母细胞、透明带、放射冠及部分卵泡细胞突入卵泡腔内形成卵丘
3、；卵泡腔周围的数层卵泡细胞形成卵泡壁，称颗粒层，卵泡细胞改称颗粒细胞。初级卵泡和次级卵泡合称生长卵泡，其周围形成卵泡膜。卵泡膜内层有多边形或梭形的膜细胞，具有分泌类固醇激素细胞的特征；外层有胶原纤维和平滑肌纤维，膜细胞合成雄激素，雄激素进入颗粒细胞，转化为雌激素，故雌激素由两种细胞联合产生。成熟卵泡 在 LH 刺激下，次级卵泡发育为成熟卵泡。初级卵母细胞直径可达 150m。由于卵泡液急剧增多卵泡体积显著增大，直径可超过 2cm，并向卵巢表面突出。在排卵前 3648 小时，初级卵母细胞完成第一次减数分裂，形成次级卵母细胞和第一极体。第一极体很小，含极少量胞质。次级卵母细胞迅速进入第二次减数分裂，
4、停滞在分裂中期。3绝大多数卵泡不能发育成熟，它们在发育的各个阶段停止生长并退化，退化的卵泡称闭锁卵泡。精子的发生精子发生的全过程是在精巢内进行的。各种动物的精巢结构不同，精子的形态也各种各样，但是精子发生的规律基本相似。精子发生都必须经历增殖期、生长期、成熟期和精子形成期这几个阶段。生精细胞包括精原细胞（spermatogonium）、初级精母细胞（primary spermatocyte）、次级精母细胞（secondary spermatocyte）、精子细胞（spematid）和精子（sperm）。在生精细胞之间还分布着一种称之为支持细胞（sertoli cell）的体细胞。它对生精细胞具
5、有支持、营养和分解残余物质的作用，也具有调节精子发生和诱导精子形成的作用。精子的发生是一个连续的过程。在哺乳类精巢中有许许多多的生精细管，在生精细管上有规律地分布着各期生精细胞。而在两栖类或鱼类，精子的发生有着明显的季节性变化。在精巢中生精细胞分布在精小叶中，各期生精细胞以精小囊为单位。在同一个精小囊中的生精细胞往往为同一发育期的生精细胞，不同精小囊的生精细胞发育不同步。本实验以哺乳类、蛙的精巢为材料，观察精子的发生过程和精子的形态特征。一、精子的发生1、取哺乳类精巢切片，置显微镜下先用低倍镜观察，可见在整个精巢外表有一层较厚的结缔组织膜，称白膜（tunica albuginea），白膜的结缔
6、组织伸到精巢内形成一些结缔组织小隔，称精巢小隔（septula testis），把精巢分隔成许多锥形小叶，每个小叶有 1-4 条生精细管。在切片中可见生精细管多呈横切面，每个生精细管外有一薄层的结缔组织。选一生精细管置高倍镜及油镜下仔细观察，注意生精细管的管壁由数层发育不同时期的生精细胞所构成，自管壁向管腔依次排列如下：4精原细胞 为生精细管管壁上最外层的生精细胞，紧附于结缔组织之内，通常为一层细胞，呈圆形，胞核染色深。精原细胞经过若干次有丝分裂后，最后一代的细胞长大为精母细胞。初级精母细胞 初级精母细胞位于精原细胞的内方，为生精细管上各期生精细胞中体积最大的细胞，有二、三层。核非常明显，可见
7、到处于减数分裂前期不同时期的变化，有时还可见到正在进行第一次成熟分裂。次级精母细胞 初级精母细胞经第一次成熟分裂后形成次级精母细胞，大小为初级精母细胞的一半，位于初级精母细胞的内方。次级精母细胞的染色体已减少一半，为单倍体，细胞染色较浅。由于次级精母细胞存在的时间很短，所以在切片中数目有时也少，通常为一、二层。精子细胞 次级精母细胞经过第二次成熟分裂，形成精子细胞。精子细胞位于次级精母细胞的内方，接近生精细管的管腔。精子细胞较次级精母细胞小，细胞呈卵圆形，细胞核染色深，有的可见到精子细胞在精子形成中的不同形态变化。精子 精子细胞完成分化过程形成精子。精子位于生精细管的管腔中，精子聚集成束，一般
8、头部朝向管壁或深埋在支持细胞的细胞质中。精子具有染色很深的头部和鞭毛状的尾部。4.实验步骤调节光源放置标片观察绘图5 作业：1）卵巢和精巢的组织构成（描述）2)各阶段卵母细胞和精巢细胞的形态特征（描述或绘图）实验二 精子获能的鉴定实验1实验器材冻置装置 水浴锅 培养皿 5ml 注射器 1ml 移液枪 枪头 倒置显微镜 载玻片 PH 试纸, 2实验试剂生理盐水、BO 培养基、 双抗、E2、 P4 、 无水乙醇、 95%乙醇 、考马斯亮蓝 G250 染液、 NaHCO3、 HCl 、 肝素3材料5冷冻精液4原理精子在离开雄性生殖系统时，虽有完整的形态和独立运动能力，但不能立刻与卵子受精，必须在雌性
9、生殖道或在体外的特定介质中进行最后成熟，即“获能” （Sperm Capacitation） ，才能与同种动物的卵子受精，这是受精过程最基本的一步，特别在体外受精技术中是相当关键的一步。精卵结合之前,精子应该具备如下能力:有能力到达卵母细胞并穿过透明带;有能力进行获能和顶体反应;成熟过程中获得的蛋白结合位点,能适时暴露给卵母细胞以结合透明带;可以与卵母细胞膜融合并且将遗传物质注入到卵子的细胞质中。精子通过附睾时已经获得上述大部分能力。但精子必须在雌性生殖道或体外培养液中停留一段时间获能以后才具备完整的授精条件。精子获能的理想场所是一新近交配的雌性生殖道。精子体外获能的实质是模仿体内获能,但体内
10、获能的效率远远比体外获能的高。精子获能是一个十分复杂的生理现象,它是顶体反应的前奏,顶体反应是获能的必然结果,是授精的必要条件。精子获能与顶体反应是使精子穿过卵细胞的透明带,发动授精过程的必需生理事件。一般认为精子获能的意义在于使精子准备发生顶体反应和超激化,促使精子穿透卵子。精子在若干生殖道获能因子的作用下，精膜发生一系列变化（吸附于精子膜表面精清蛋白的去除和膜表面蛋白重组等） ，进而产生生化和运动方式的改变。获能后精子穿越卵母细胞周围的滤泡细胞和透明带的能力提高，是精子发生顶体反应的前奏。精子一旦获能,其运动类型发生显著改变,精子头部侧摆幅度和频率明显增加,尾部振幅加大,频率加快,呈现一种
11、特殊的超激活运动(HAM)或鞭打样运动。HAM 是精子为适应受精而形成的一种特殊的运动类型,所反映的是精子运动能力和方式的改变。应用显微录像技术、连续分步曝光照相技术、计算机辅助精液分析(CASA)技术对精子运动轨迹进行分析,可以从精子运动学本质来研究和相对客观的确定超激活精子。CASA 分析系统可达到客观准确的量化精子运动状况,通过对精子头部运动轨迹摆动图型的分析可获得多项参数,使人们对精子运动有了更深层次的了解。如人精子获能后表现为精子运动轨迹速度(VCL)的增加,线形度(LIN)和直线性(STR)的降低,头部侧置量(ALH)的增加。对于群体激活精子6可用下列标准界定,即 VCL100m
12、/s, LIN65 和 ALH7. 5m /s。然而, CASA 分析系统受诸多因素的影响,该仪器难以从非精子物质中识别精子因而测定值的准确性受精液中细胞成分和非细胞颗粒物质的干扰。又因使用的仪器不同,或者设置的参数不一样,不同的实验室也会有不同的 CASA 界定标准,偏差较大,至今尚未找到公认的统一手段。顶体反应(AR)是精子在受精过程中经历的重要环节之一。AR 与精子获能密切相关，并且标志着获能的完成，主要表现为精子顶体的囊泡化，即精子获能时，头部质膜首先出现不同程度的膨胀，有些精子经过头部的互相帖挥，质膜很快破裂、脱落，顶体内电子密度较大的物质形成致密小团块，顶体囊泡化是在双层顶体外膜之
13、间经过局部融合而形成的，随后逐步溶解脱落，顶体内膜仍包在精子核膜外面，有时在顶体延伸部也形成一些小泡。考马斯亮蓝染色法，CBB 是常用的蛋白质染色剂，经考马斯亮蓝染色后，完整的精子即未获能的精子顶体外膜内含有的大量糖蛋白，精子头部顶端顶体区呈深蓝色，而获能后的精子其顶体膜破裂，糖蛋白被释放出来，顶体区不着色，反差明显，容易辨别。CBB 染色结果在普通光学显微镜下观察:染色后，所有精子尾部均染成紫蓝色，头部则呈 A 型和 B 型两种染色类型。A 型为没有发生顶体反应的精子，顶体区染成紫蓝色而顶体后区不染色或呈浅紫色，少量精子顶体后区也呈紫蓝色;B 型为已发生顶体反应的精子，顶体区不染色或染浅紫色
14、，其余部位染色与 A 型相似。两类精子的根本差别是顶体区是否染成紫蓝色。考马斯亮蓝检查结果的稳定性重复性好，批内之间的差异不大，可以在普通实验室中进行，但在辨别获能型精子上有其局限性，表现为“B”型的精子可能包括了已经获能而未发生顶体反应的精子。近年来有学者采用考马斯亮蓝R250 来检测小鼠精子 AR，江一平等人已将此法移用于人精子 AR 的检测上，并推广到多种哺乳动物精子 AR 的检测中。Larson 采用考马斯亮蓝 G250 来检测包括人、牛、猪、兔和小鼠等精子的 AR，二者都采用经典的荧光亲合技术 PSA 法证明其可靠性。5实验步骤5.1 精子获能71) 冷冻精子的复苏：恒温水浴锅温度调
15、至 37，等水温恒定后将冷冻精液管放入其中 15 分钟。取精液 1 ml 加培养液 3 ml 混匀置于倒置显微镜下观察精子的形态特征和运动状况，同时涂片考马斯亮蓝染色镜检，观察获能前精子的染色特征。2) 获能精子的制备：取精液 1 ml 加培养液 3 ml 混匀,500 r/min 离心 5 min,弃上清液,同法再洗涤 1 次,加培养液 1 ml 后置 37水浴，培养管倾斜 20,45 min 后垂直取上清液约 2 ml 置倒置显微镜下检查精子运动情况。3) 获能精子的涂片染色观察：用移液管取少量稀释液置于载玻片上，然后推开稀释液，风干以后将涂片浸染于考马斯亮蓝染色液中 5min,然后用流水
16、冲干净，在显微镜下观察精子的染色情况。记录精子获能情况，并计算精子获能率。6观察结果：描述精子的形态特征，运动状况，绘制精子考马斯亮蓝涂片染色示意图！描述获能精子与未获能精子在考马斯亮蓝染色上的不同，计算精子获能情况。5.2 黄体酮对牛精子获能的影响1）牛精子的复苏与洗涤取牛冻精，混匀，1500R/MIN 离心 5 分钟，去上清液。精子沉淀分别加于3 支各盛 3ml 洗液的试管底部，C02 培养箱(37，5%c02)放置，收集上层含高活力精子的悬浮液，离心，去上清液，沉淀加 5ml 洗液洗涤 1 次。2）精子获能用肝素刺激精样获能，调整精子数为 2x106个/ml，置于 38水浴中，处理 30 分钟。将精液分别加入含不同浓度(0、1、5、10mol/L)孕酮的 BO 工作液中，然后放入恒温培养箱中孵育,于 240-360 min 取出少量进行染色检验。3）染色鉴定：按照考马斯亮蓝染色的方法进行精子的获能鉴定，按照下表记录实验数据。孕酮对精子获能的
