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1、缓冲液流动相可以根据下面的操作步骤配制：1 将缓冲液药品溶解在水中制成缓冲液（溶液 A） 。2 用 pH 计确定或调节溶液 A 的 pH。3 将一定体积（如 200ml）的有机溶剂 B 与由步骤 2 配制的溶液 A（如 800ml）混合，制成最终流动相（此处的有机相为 20%） 。4 检查最终流动相的 pH（此处为选项） 。由于测定含有有机调节剂的流动相 pH 计发生漂移，使其测定 pH 不很可靠，所以上面的步骤 4 一般只有在考察误差的主要来源时采用，大多数实验室皆略去此步骤。步骤 1 一般是将配制缓冲液所用的两种试剂（A1 和 A2）分别按计算量先溶解在水中制成水溶液，然后再将这两种溶液按
2、一定的比例混合得到预期 pH 的溶液 A。若在此步骤 2 中调节 pH，则可以采用溶剂 A 滴定溶剂 B，也可反过来滴定，并通过 pH 计测量得到所需pH 的最终缓冲溶液。在大多数实验室中，pH 的测量精度通常不会达到0.050.1 个 pH 单位，这会显著影响一些样品的分离。当HPLC 方法对 pH 非常敏感时，步骤 2 只能大致确定 pH 值。将准确称重的缓冲液配制试剂与精确体积的脱气蒸馏水混合，使其成为均一的溶液（不进一步调整 pH） ，如此配得缓冲溶液的 pH 可以控制在非常窄得范围内（0.02 单位） ，已知准确 pH 值的缓冲液浓溶液已有市售。为了改善峰形或塔板数，有时在流动相中加
3、入酸或碱（如三乙胺、乙酸等） ，如果这些添加剂并非为配制缓冲溶液时所采用得试剂，那么将这些试剂加入到流动相中后，还需重新滴加酸或碱，使流动相达到所需的 pH 值。常用缓冲液的配制当缓冲液被稀释或浓缩时，pH 也应不变。其 pH 值应近似恒定不变，或当其中的离解的阳离子（K+、Na+）或阴离子（Cl- 、Br- ）被其它种类的离子替换时。表 14 中给出了响应的配制方法，平衡阳离子为 Na+，缓冲液的最终浓度为 0.1mol/l，对于其它浓度的缓冲溶液或阳离子种类（通常K+）更好，表中的数据也可供参考。较稀的或较浓的缓冲溶液，及包含有不同阳离子的溶液，其 pH 值会与表中的数据稍有出入。在方法建
4、立过程中，精确的流动相 pH 值往往并不重要，重要的是每次新配制的流动相的 pH 值与第一次基本相同（最好控制在0.02 范围内） 。注意，只有当缓冲溶液的 pH 在缓冲试剂解离常数 pKIa1范围内时，缓冲溶液才具有有效的缓冲容量（如乙酸盐的pKa=4.6，其适宜的 pH 范围为 3.65.6） 。表 1 低 pH 值（25）磷酸盐缓冲溶液的配制方法溶液 A1：0.1M 磷酸。配制精确 pH 值缓冲液时，所用磷酸需滴定H3PO4 的含量。溶液 A2：0.1M 磷酸二氢钠溶液，称量 13.8g NaH2PO4H2O 溶解于水中，定容于 1L 容量瓶中。 pH A1 体积（ml） A2 体积（m
5、l） pH A1 体积（ml） A2 体积（ml ）2.0 565 435 2.8 175 8252.2 455 545 3.0 110 8902.4 345 655 3.2 55 9452.6 250 750 表 2 不同 pH 值（25）醋酸缓冲溶液的配制方法溶液 A1：0.1M 醋酸溶液。6.0g（5.8ml）冰醋酸溶于水中，定容到1L 容量瓶中。溶液 A2：0.1M 醋酸钠溶液。8.2g C2H3O2Na（或 13.6g C2H3O2Na3H2O）溶解于水中定容到 1L 容量瓶中。pH A1 体积（ml） A2 体积（ml） pH A1 体积（ml） A2 体积（ml ）3.6 926
6、 74 4.8 400 6003.8 880 120 5.0 296 7044.0 820 180 5.2 210 7904.2 736 264 5.4 176 8244.4 610 390 5.6 96 9044.6 510 490 表 3 不同 pH 值（25）柠檬酸缓冲溶液的配制方法溶液 A1：0.1M 柠檬酸溶液。21.0g 柠檬酸溶于水中，定容到 1L 容量瓶中。溶液 A2：0.1M 柠檬酸钠溶液。29.4g C6H5O7Na32H2O 溶解于水中，定容到 1L 容量瓶中。pHA1 体积（ml） A2 体积（ml） pH A1 体积（ml） A2 体积（ml）3.0 930 70 5
7、.0 410 5903.2 870 126 5.2 360 6603.4 810 190 5.4 320 6803.6 750 260 5.6 270 7263.8 700 300 5.8 230 7644.0 660 340 6.0 190 8104.2 610 370 6.2 140 8564.4 560 440 6.4 60 9404.6 510 490 6.6 40 9604.8 460 540 6.8 30 9705.0 410 590 7.0 10 9855.2 360 660表 4 中等 pH 值（25）磷酸缓冲液的配制方法溶液 A1：0.1M 磷酸二氢钠溶液。13.8g NaH
8、2PO4H2O 溶于水中，定容到 1L 容量瓶中。溶液 A2：0.1M 磷酸氢二钠溶液。26.8g Na2HPO47H2O（或 35.9g Na2HPO412H2O）溶于水中，定容到 1L 容量瓶中。pH A1 体积（ml） A2 体积（ml） pH A1 体积（ml） A2 体积（ml ）5.6 948 52 7.0 390 610 5.8 920 80 7.2 280 7206.0 877 123 7.4 190 8106.2 815 185 7.6 130 8706.4 735 265 7.8 85 9156.6 685 315 8.0 53 947 6.8 510 490 表 5 和
9、6 给出了适于 pH=710.6 范围的两种有机碱缓冲液配制方法，这种有机碱缓冲液可以有效低减缓硅胶基柱的柱效降低。表 5 高 pH（25）甘氨酸缓冲溶液的配制方法溶液 A1：0.2M 甘氨酸。15.01g 甘氨酸溶于水中，定容于 1L 容量瓶中。溶液 A2：0.1M NaOH 溶液，稀释较浓的 NaOH 溶液。pH A1 体积（ml） A2 体积（ml） pH A1 体积（ml） A2 体积（ml ）8.6 25 2.0 9.6 25 11.28.8 25 3.0 9.8 25 13.69.0 25 4.4 10.0 25 16.09.2 25 6.0 10.4 25 19.39.4 25
10、8.4 10.6 25 22.75表 6 高 pH 值（25）Tris 缓冲溶液的配制方法溶液 A1：0.1M Tris（无碱） ，12.11g Tris 溶于水中，定容到 1L 容量瓶中。溶液 A2：0.1M HCl 溶液，稀释较浓 HCl 溶液。pH A1 体积（ml） A2 体积（ml） pH A1 体积（ml） A2 体积（ml ）7.1 50 45.7 8.1 50 26.27.2 50 44.7 8.2 50 22.97.3 50 43.4 8.3 50 19.97.4 50 42.0 8.4 50 17.27.5 50 40.3 8.5 50 14.77.6 50 38.5 8.6 50 12.47.7 50 36.5 8.7 50 10.37.8 50 34.5 8.8 50 8.57.9 50 32.0 8.9 50 7.08.0 50 29.2
