《汉族人群聚腺苷二磷酸核糖聚合酶 》由会员分享，可在线阅读，更多相关《汉族人群聚腺苷二磷酸核糖聚合酶 （9页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、精品文档2016 全新精品资料-全新公文范文 -全程指导写作 独家原创 1 / 9汉族人群聚腺苷二磷酸核糖聚合酶 作者：梁海荣，唐焕文，胡大林，庄志雄 【关键词】 苷二磷酸核 【摘要】 目的：通过检测人聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1（hPARP1）7 个外显子核苷酸多态性，了解在广东的汉族人群中 hPARP1 基因多态性分布，为建立民族特色的 DNA 修复基因多态性数据提供基础资料。方法： 选取在广东地区的汉族健康人群 320 名的基础资料及血液样本，抽提血液DNA，用 PCR 法扩增 hPARP1 基因 7 个外显子，采用聚合酶链式反应（PCR）单链构象多态性(SSCP)和银染技术检测hPARP1
2、 基因多态性，并进行 DNA 序列测定。结果： 在广东的汉族正常人 320 名血标本的 7 个外显子扩增产物 SSCP 电泳条带中，4 个样本 hPARP1 基因外显子 17 的 SSCP 电泳条带检出 1 条多态性条带，3 个样本第 12 内含子检出 1 条多态性条带，其余 6 个外显子扩增产物 SSCP 电泳未见多态性条带。正常带型 DNA 测序结果与 genebank 中已知序列完全一致，第 17 外显子上有 1 种基因突变类型（TC） 。结论：在广东地区的汉族人群的 hPARP1 基因第 17 外显子和第 12 内含子上可能存在多态性。 【关键词】聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1；遗传多态性；
3、聚合酶链反应 【Abstract】 Objective: To investigate the 精品文档2016 全新精品资料-全新公文范文 -全程指导写作 独家原创 2 / 9nucleotide polymorphisms and distributions of seven exons in human poly (ADPribose) polymerase1 (PARP1) gene and to contribute to the construction of the special DNA repair gene polymorphisms databank. Methods:
4、The basic materials and blood samples from 320 Guangdong health Han population were collected. The polymorphism of exon 3,11,12,13,16,17 and exon 20 of hPARP1 gene were detected by PCRSSCP, and sequencing test were performed. Results: A polymorphisms of exon 20 of PARP1 gene was detected in 320 Han
5、people by PCRSSCP, no abnormal bands were observed from the analysis of PCRSSCP in other exons. Also, DNA sequence of normal bands turned out that PCR products were target ones in Genebank, one type mutations (TC) and (GA)were detected in exon 17 and in intron 12. Conclusion: Polymorphisms may exist
6、 in exon 17 and intron 12 of hPARP1 gene in Guangdong Han population. PCRSSCP silver staining could be as a tool to screen rapidly the polymorphisms hPARP1 gene. 【Key words】 poly (ADPribose) polymerase1; genetic polymorphism; polymerase chain reaction 精品文档2016 全新精品资料-全新公文范文 -全程指导写作 独家原创 3 / 9DNA 修复系
7、统在修复 DNA 损伤、维持基因组完整和稳定性中起着不容忽视的作用。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶 1poly (ADPribose) polymerase1，PARP1是真核细胞中存在的一种蛋白质翻译后修饰酶。可参与许多与细胞功能有关的重要反应，并与癌症的发生、发展和治疗、预后密切相关，对维持 DNA 的完整性方面起着重要的作用1 ，其多态位点的确认对疾病易感性的流行病学研究具有重大意义。基因检测能有效筛查基因突变携带者，可以为进一步鉴定该突变功能上的意义提供基础的分子遗传学资料，因而具有重要的意义。本文应用 PCRSSCP 基因筛查技术和分子流行病学方法检测了在广东的汉族人群中正常人 hPARP1
8、 基因的多态性，为 hPARP1 基因多态性人群分布和建立民族特色的DNA 修复基因多态性数据库提供基础资料。现将结果报道如下。 1 方法 1.1 样本收集 选取在广东地区的健康状况良好(通过体检选择取)、无家族史和遗传病史、三代及以上均为汉族的 320 名个体（其中男 174 例，女 146 例，年龄 3867 岁，平均年龄（43.156.70）岁）并取血样标本。 1.2 血液 DNA 的抽提2 采集外周抗凝全血 5 mL，用经典酚氯仿法提取外周血精品文档2016 全新精品资料-全新公文范文 -全程指导写作 独家原创 4 / 9DNA，并在 4 保存。 1.3 引物设计 根据已确定的 hPA
9、RP1 基因 cDNA 和内含子/外显子连接序列，用 Primer Premier 5.0 引物设计软件设计 hPARP1 基因 7 个外显子的引物，该引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成 (表 1) 。表 1 扩增 hPARP1 基因外显子的引物序列 1.4 PCR 扩增 PCR 反应总体积为 25 L，各成分终浓度为：引物 0.125 mol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Mg2+1.8 mmol/L，DNA 模板25250 ng，Taq DNA 聚合酶 2.5u。反应参数为：98预变性 5 min，94 30s，5359 30s，72 45s，30 次循环后 72 延伸 8
10、min。以 2 琼脂凝胶对扩增产物进行鉴定。若与 DNA 分子量标准相比，扩增产物大小一致，无杂带，则可用于单链构象多态性(SSCP)分析。 1.5 SSCP 分析 1.5.1 8聚丙烯酰胺凝胶的配制 40丙烯酰胺 8 mL，10Tris/硼酸电泳缓冲液 (TBE) 4 ml，10过硫酸胺（AP）0.8 mL，N,N,N,N四甲基乙二胺(TEMED)53 L，甘油 4 mL，加水至 40 mL。将聚丙烯酰胺凝胶混合物倒入玻璃板夹层，插入梳子，让凝胶在室温下聚合 4050 min，拔出梳子，冲洗样孔。根据 PCR 产物的浓度，取精品文档2016 全新精品资料-全新公文范文 -全程指导写作 独家原
11、创 5 / 90.22 L 产物加入 20 L 甲酰胺变性液（98去离子甲酰胺，0.05%溴酚蓝和 0.05%二甲苯青）中混匀，95 热变性 5 min，立即置于冰上，点样于预电泳 30 min 的上述8聚丙烯酰胺凝胶中，在 48 环境中 300V 电泳 610 h。 1.5.2 银染步骤 参照文献3进行(1) 10 乙醇浸泡 5 min；(2) 1 HNO3 浸泡 5 min；(3) 0.2 AgNO3 浸泡 20 min；(4)显影液(20 mL 1.4 mol/L 无水碳酸钠50L 甲醛80 mL 去离子水)，至条带出现； (5) 10 醋酸浸泡 5 min。以上每一步后均用去离子水洗
12、2 次，观察结果并扫描成像保存。对阳性结果样本进行 23 次 PCRSSCP 银染重复试验。 1.6 DNA 序列测定 对 SSCP 分析有异常泳动带的外显子，扩增 DNA 样本，采用 ABI377 全自动基因分析仪对其进行 DNA 序列测定并与GeneBank 中所报道的序列进行比较。 2 结果 2.1 DNA 抽提结果 所抽提 DNA 样本浓度及纯度，均可用于后续实验研究。 2.2 PCR 扩增 320 份 DNA 样本的 hPARP1 基因 7 个外显子均得到成功扩增，各外显子 PCR 反应产物均为单一条带，大小在 175362bp精品文档2016 全新精品资料-全新公文范文 -全程指导
13、写作 独家原创 6 / 9之间，与预计扩增片断大小一致 (图 1) 。 2.3 SSCP 分析 经 PCRSSCP 对 7 个外显子进行遗传多态性检测，320 名汉族人中有 4 名的外显子 17 和 3 名测序检出内含子 12 出现多态位点，出现 2 种稳定的带型，显示 3 条变性单链带（异常泳动条带位置在 2 条正常单链的中间） ，其余 6 个外显子均未发现异常带型，显示 2 条变性单链带（图 2） 。 2.4 测序 正常样本 7 个外显子双向测序结果表明，所扩增序列分别与 Genbank 中 hPARP1 基因 7 个外显子的符合率达到100。4 例异常样本第 17 外显子和 3 例异常样
14、本第 12 外显子测序结果，所扩增序列有一处碱基发生突变，外显子17 在密码子 808 处出现 CACCGC，即组氨酸精氨酸；第12 外显子测序发现 12 内含子在 18731 位出现 GA 改变(图 3，图 4)。 18 泳道分别为外显子 20、17、3、11、 DNA Mark DL2000 及外显子 12、13、16。 图 1 PCR 产物在 2琼脂糖凝胶上电泳结果 第 6 泳道为异常标本，其余泳道为正常标本；“”：正常单链， “”：异常单链。 图 2 hPARP1 基因外显子 17 PCR 产物在 8非变性聚丙烯酰胺凝胶上的电泳图 精品文档2016 全新精品资料-全新公文范文 -全程指
15、导写作 独家原创 7 / 9第 12 内含子的 18731 位出现 GA 的杂合性突变。 图 3 第 12 内含子正向测序图 异常泳动条带样本第 17 外显子反向测序结果：密码子 808 出现 TC 的杂合性突变。 图 4 第 17 外显子反向测序图 3 讨论 PCRSSCP 银染技术是一种检测基因突变非常敏感的方法。在大样本量的分子流行病学研究中, 往往需要对多个基因或同一基因的多个外显子进行突变筛查, 这种工作不仅工作量大, 耗费大, 操作繁琐, 而且不易进行质量控制。本实验结果表明，SSCP 多重 PCR 法是一种快速检测正常人群hPARP1 基因多态性的有用技术。它比用于检测基因突变的其它方法4 ，如变性梯度凝胶电泳法、限制性片段长度多态性和直接测序更简单、更省财省力，适用于大样本量人群的基因突
