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1、一、GST pull-down 实验基本原理:将靶蛋白-GST 融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过 SDS-PAGE 电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。此方法简单易行,操作方便。注：GST 即谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase)二、足印法（Footprinting）足印法（Footprinting）是
2、一种用来测定 DNA-蛋白质专一性结合的方法，用于检测目的DNA 序列与特定蛋白质的结合，也可展示蛋白质因子同特定 DNA 片段之间的结合。其原理为：DNA 和蛋白质结合后，DNA 与蛋白的结合区域不能被 DNase（脱氧核糖核酸酶）分解，在对目的 DNA 序列进行检测时便出现了一段无 DNA 序列的空白区(即蛋白质结合区)，从而了解与蛋白质结合部位的核苷酸数目及其核苷酸序列。三、染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是研究体内蛋白质与DNA 相互作
3、用的有力工具，利用该技术不仅可以检测体内反式因子与 DNA 的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰以及转录因子与基因表达的关系。染色质免疫沉淀技术的原理是：在生理状态下把细胞内的 DNA 与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别 反应，将与目的蛋白相结合的 DNA 片段沉淀下来。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA 的纯化及鉴定。四、基因芯片（又称 DNA 芯片、生 物 芯 片 ）技术基因芯片指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样 品 分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取
4、样品分子的数量和序列信息。通俗地说，就是通过微加工技术 ，将数以万计、乃至百万计的特定序列的 DNA 片段（基因探针），有规律地排列固定于 2cm2 的硅片、玻片等支持物上，构成的一个二维 DNA 探针阵列，被称为基因芯片。基因芯片主要用于基因检测工作 。基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核 酸 探 针 杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的八核 苷 酸 的探针。当溶液中带有荧 光 标记的核酸序列 TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的
5、序列。五、高效液相色谱（HPLC）高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送；色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。高压泵将贮液罐的流动相经进样器送入色谱柱中，然后从检测器的出口流出，这时整个系统就被流动相充满。当欲分离样品从进样器进入时，流经进样器的流动相将其带入色谱柱中进行分离，分离后不同组分依先后顺序进入检测器，记录仪将进入检测器的信号记录下来，得到液相色谱图。六、酵母双杂交（Y2H）七、噬 菌 体 展 示 技术噬 菌 体
6、 展 示 技术是将外源蛋白或多肽的 DNA 序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时,外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合
7、吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过 3 轮5 轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集。所得的噬菌体制剂可用来做进一步富集有期望结合特性的目标噬菌体。八、RNA 提取（Trizol 法）Trizol 试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使 RNA 与蛋白质分离，并将 RNA 释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使 RNA 进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样 RNA 与仍留在有机相中的蛋白质和 DNA 分离开。水相层（无色）主要为 RNA，有机层（黄色）主
8、要为 DNA 和蛋白质。九、RT-PCRRT-PCR 是将 RNA 的反转录（RT）和 cDNA 的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从 RNA 合成 cDNA，再以 cDNA 为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR 可以一步法或两步法的形式进行。在两步法 RT-PCR 中，每一步都在最佳条件下进行。实验步骤：1、RNA 的提取；2、反转录合成 cDNA；3、PCR 扩增；4、产物的电泳和结果的测定。十、实时荧光定量 PCR（QPCR）（Real-time Quantitative PCR ）利用荧光信号的变化实时检测 PCR 扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过
9、 Ct 值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析。阈值：是循环开始 315 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍，设定在扩增曲线指数增长期。C(t)值：荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的扩增循环次数。十一、BCA 法测蛋白质浓度十二、大肠杆菌感受态细胞（E.coli DH5）制备1、前夜接种受体菌（DH5 或 DH10B），挑取单菌落于 LB 培养基中 37摇床培养过夜（约16 小时）；2、取 1ml 过夜培养物转接于 100ml LB 培养基中，在 37摇床上剧烈振荡培养约 2.5-3 小时（250-300rpm）；3、将 0.1M CaCl2 溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台
10、和冰上操作；4、吸取 1.5ml 培养好的菌液至 1.5ml 离心管中，在冰上冷却 10 分钟；5、4下 3000 g 冷冻离心 5 分钟；6、弃去上清，加入 100 微升预冷 0.1M CaCl2 溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置 20 分钟；7 、4下 3000 g 冷冻离心 5 分钟；8 、弃去上清，加入 100 微升预冷 0.1M CaCl2 溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9 、细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（70）。十三、碱变性提取质粒 DNA碱变性提取质粒 DNA 是基于染色体 D
11、NA 与质粒 DNA 的变性与复性的差异而达到分离目的。在 pH 高达 12.6 的碱性条件下，染色体 DNA 的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA 的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以 pH4.8的 NaAc 高盐缓冲液去调节其 pH 至中性时，变性的质粒 DNA 又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体 DNA 不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体 DNA 与不稳定的大分子 RNA、蛋白质-SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去。十四、目的基因的连接、转化及克隆筛选（1）总过程：分-PCR 分离目的基因切-限制性内切酶切割接-目的基因与载体
12、相连转-转入宿主细胞筛-筛选阳性重组体（2）分-PCR 分离目的基因：PCR 克隆、同源克隆、文库筛选（3）切-限制性内切酶切割：粘性末端、平末端（4）接-目的基因与载体相连原 理：利用 DNA 聚合酶反应时都有在 PCR 产物的 3末端添加一个或者几个 A 碱基的特性和利用 T 载体 3末端的 T 碱基和 PCR 产物的 A 碱基互补配对,经连接酶作用,完成与载体的连接。（5）转-转入宿主细胞感受态细胞：经过电击、 CaCl2、 RuCl 等化学试剂处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源 DNA 分子通过时细胞的状态。（6）筛-筛选阳性重组体十五、RNA 干扰（RNAi）一些小的双链
13、 RNA(siRNA)可以通过促使特定基因的 mRNA 降解来高效、特异的阻断体内特定基因表达，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为 RNA 干扰（RNAi）。十六、cDNA 末端快速扩增 (rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术cDNA 末端快速扩增 (rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术是一种基于 mRNA 反转录和 PCR 技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点,扩增基因转录本的未知区域,从而获得 mRNA(cDNA)完整序列的方法。简单的说就是一种从低丰度转录本中快速增长cDNA5和 cDNA3
14、末端，进而获得获得全长 cDNA 简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便、高效等优点,可同时获得多个转录本。因此近年来 RACE 技术已逐渐取代了经典的cDNA 文库筛选技术,成为克隆全长 cDNA 序列的常用手段。十七、基因文库和 cDNA 文库的构建（看课本上的）十八、mRNA 差异显示技术（DD-PCR）mRNA 差异显示技术是将 mRN A 逆转录技术和 PCR 技术相结合的一种 RNA 指纹图谱技术。每一种细胞（包括同一组织细胞经过不同的处理）都有其特异表达的不同于其他组织细胞的基因谱（有差异基因表达），即特异的 RNA 指纹图谱。差异基因表达是细胞分化的基础，正是这些基因在细胞中的
15、特异表达与否，决定了生命历程中细胞的发育和分化、细胞周期调节、细胞衰老和凋亡等。mRNA DDR TPCR 技术正是对组织特异性表达基因进行分离的一种快速而行之有效的方法。 其基本原理是从基因背景相同的 2 个或几个被比较的细胞系或组织中提取总 RNA，逆转录成 cDNA ，用不同引物对，进行 PCR 扩增，扩增时加入同位素标记的核苷酸。利用测序胶电泳技术分离 PCR 产物，经放射自显影即可找到差异表达的基因。十九、抑制差减杂交抑制差减杂交技术原理抑制差减杂交技术(SSH)是由 Diatchenko 等建立的以抑制性 PCR 和DNA 差减杂交方法相结合的方法。其依据的主要技术有两点:(1)消
16、减杂交;(2)抑制 PCR。经抑制差减杂交后的 cDNA 群体不仅富集了差异表达基因(目的基因),而且目的基因间丰度的差异经过均等化作用已基本消除,使消减后的 cDNA 群体为丰度一致的目的基因群体。抽提两种不同来源组织的 mRNA(tester 和 driver),反转录成 cDNA,用 4 碱基识别酶(RsaI)或 HaeIII 酶切两种 cDNA 产生平端片段;将 testerc DNA 分成均等的两份,分别接上dapter1 和 adapter2 两种接头,并与过量的经 RsaI 消化的 driver 样本变性后退火杂交。第一次杂交后有 4 种产物:a 是单链 testercDNA;b 是自身退火的 testercDNA 双链;c 是tester 和 driver 的异源双链;d 是 drivercDNA。根据复性动力学原理,丰度
