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1、第四节 黄酮类化合物的检识与结构鉴定 目前主要采用的方法有： 与标准品或与文献对照 PPC或 TLC得到的 Rf或 hRf值 （ Rf100） 分析对比样品在甲醇溶液中及加入诊断试剂后得到的 UV光谱 1H -NMR 13C -NMR MS 一、色谱在黄酮类鉴定中的应用 1. 纸层析 (PPC) 苷类成分可采用双向展开 ， 第一相展开采用醇性溶剂 ， 如 BAW系统 （ 正丁醇： 醋酸：水 4： 1： 5上层 ） ；第二相展开用水性溶剂 ，如氯仿：醋酸：水 （ 3： 6： 1） 苷元则多采用醇性溶剂 。 花色苷及其苷元 ， 可用含盐酸或醋酸的溶剂 。 显色剂： 2%三氯化铝甲醇液 （ 紫外光下
2、检测 ） ； 1%FeCl3 / 1%K3Fe(CN)6(1:1)混合液 。 2. 薄层层析 (TLC) ） 硅胶薄层 用于弱极性黄酮较好 。 常用甲苯：甲酸甲酯：甲酸 （ 5： 4： 1） ；苯：甲醇 （ 95： 5） 或苯：甲醇：冰醋酸（ 35： 5： 5） 等 。 ） 聚酰胺层析 适用范围广 ， 可分离含游离酚羟基或其苷类 。 常用展开系统：乙醇：水 （ 3： 2） ；丙酮：水 （ 1： 1） 等 。 二、紫外光谱在黄酮类鉴定中的应用 可用于确定黄酮母核类型及确定某些位置是否含有羟基 。 一般程序： 测定样品在甲醇中的 UV谱以了解母核类型； 在甲醇溶液中分别加入各种诊断试剂后测 UV谱
3、和可见光谱以了解 3,5,7,3,4有无羟基及邻二酚羟基； 苷类可水解后 （ 或先甲基化再水解 ） ， 再用上法测苷元的 UV谱以了解糖的连接位置 。 （一）黄酮类化合物在甲醇溶液中的紫外光谱 多数黄酮类化合物由两个主要吸收带组成： 带 I在 300-400nm区间 ， 由 B环桂皮酰系统的电子跃迁所引起 。 OOOOB B 带 II在 240-285nm区间，由 A环苯甲酰系统的电子跃迁所引起。 OOOOA A 带 II(240-285nm)（苯甲酰系统） 带 I(300-400nm) 桂皮酰系统 类 型 说 明 250-285 304-350 黄酮类 -OH越多，带I带 II越红移 B环
4、3,4有 -OH基，带 II为双峰（主峰伴肩峰） 328-357 黄酮醇类 (3-OR) 352-385 黄酮醇类(3-OH) 245-270 270-295 300-400 异黄酮类 二氢黄酮（醇） B环上有 -OH, OCH3对带 I影响不大 220-270 340-390 或 340-390(Ia) 300-320(Ib) 查耳酮类 查耳酮 2-OH使带 I红移的影响最大 370-430(3-4个小峰 ) 橙酮类 不同类型黄酮类化合物的紫外光谱 2加入诊断试剂后引起的位移及结构测定 加入试剂 带 II 带 I 说明 样品 +MeOH （ 黄酮类及黄酮醇类 ） 250-285 304-38
5、5 两峰强度基本相同 ， 具体位置与母核上电负性取代基 (-OH, -OCH3)有关 ， -OH, -OCH3越多 ，越长移 +NaOMe A 环有 -OH， 红移小 ，无意义 40-60nm（ 不变或增强 ） 50-60nm（ 下降 ） 有 4-OH， 无 3-OH 有 3-OH， 无 4- OH 有 3,4-OH或 3,3,4-OH（ 衰减更快 ） 7-OH 带 I， II随加 NaOMe时间延长 ， 逐渐衰减 320-330nm有吸收 ， 成苷后消失 +NaOAc (未熔融 ) 5-20 在长波一侧有明显的肩峰 7-OH +NaOAc (熔融 ) 4065 有 4-OH +NaOAc/
6、H3BO3 5-10 12-30 有 6,7-OH或 7,8-OH (5,6-OH无 ) B环有邻二酚羟基 AlCl3/ HCl 60 50-60 35-55 17-20 0 有 3-OH 有 3,5-二 OH 有 5-OH， 无 3-OH 有 6-OR 无 3-OH, 5-OH AlCl3 光谱 -AlCl3/ HCl光谱 30-40 50-65 0 B环有邻二酚羟基 A,B环皆有邻二酚羟基 A,B环皆无邻二酚羟基 说明： （ 1） +NaOMe或 NaOAc, OHONa， 变为离子化合物 ， 共轭系统中的电子云密度增加 ，红移 另有 3,4-OH或 3,3,4-OH时 ， 在 NaOMe
7、作用下易氧化破坏 ， 故峰有衰减 。 （ 2） NaOAc为弱碱 ， 仅使酸性较强者 ， 如7,4-OH解离 。 （ 3） H C l / H 2 OA l C l 3A l3 +OOO HO HOH OA l3 +A l3 +OOOOOH OOOO HO HH OO H形成络合物的能力： 黄酮醇 3-OH 黄酮 5-OH（ 二氢黄酮 5-OH） 邻二酚羟基 二氢黄酮醇 5-OH 邻二酚羟基和二氢黄酮醇 5-OH在酸性条件下不与AlCl3络合； 但不在酸性条件下 ， 五者皆与 Al3+络合； 形成络合物越稳定 ， 红移越多 。 （ 4） 根据只加 AlCl3和加入 AlCl3及盐酸的紫外光谱吸
8、收峰位相减的结果，可以判断邻二酚羟基的取代情况。 山柰苷 山柰酚 UVmax(nm) 带 II 带 I 带 II 带 I MeOH 265 345 267 367 NaOMe 265 388 278 416（分解） AlCl3 275 399 268 424 AlCl3/HCl 275 399 269 424 NaOAc 265 399 276 387 NaOAc/H3BO3 265 345 267 367 从中药柴胡中分离得到山柰苷，经酸水解后，用 PC检出有鼠李糖，山柰苷及山柰酚的紫外光谱数据如下： OO HOO Hr h aOOr h a山柰酚 3， 7-二鼠李糖苷 三、 1H-NMR
9、常用溶剂：氘代氯仿 （ CDDl3） ， 氘代二甲基亚砜 （ DMSO-d6 ） ， 氘代吡啶（ C5D5N） 。 也可将黄酮类化合物制成三甲基硅醚衍生物溶于四氯化碳中进行测定 。 黄酮类化合物 1H-NMR谱 (DMSO-d6)羟基的特征 OO HOO HH OO HO H3575 OH： 12 ppm 7 OH： 11 ppm 3 OH： 10 ppm 氘代二甲基亚砜（ DMSO-d6）对鉴别黄酮母核上的酚羟基，是十分理想的溶剂，在试样中加入重水（ D2O）羟基质子信号消失。 （一） A环质子 1 5, 7-二 -OH黄酮 H - 6 , H - 8 , 5 . 7 - 6 . 9 , J
10、 = 2 . 5 H zH - 6 较 H - 8 高 场 86OOH OO H黄酮类 1H-NMR （三甲基硅醚衍生物溶于四氯化碳中测定） 当 7-OH成苷时，则 H-6及 H-8信号均向低场方向位移。 2 7-OH黄酮 H - 5 7 . 7 - 8 . 2 ( d , J = 9 H z )H - 6 6 . 4 - 7 . 1 ( d d , J = 9 , 2 . 5 H z ) H - 8 6 . 8 - 7 . 0 ( d , J = 2 . 5 H z ) 5OOH O68H-5较 H-6、 H-8低场 ， 是由于羰基的负屏蔽效应的影响 。 H-6、 H-8较 5, 7-二 O
11、H黄酮在较低场，且相互位置可能颠倒。 （二） B环质子 6.5-8 1 4-氧取代黄酮类化合物 5 6 3 2 O RH-3, 5 6.5-7.1, d, J=8.5Hz H-2, 6 7.1-8.1, d, J=8.5Hz 由于 C环对 H-2, 6的负屏蔽作用大于对 H-3, 5， 且 H-3, 5受 4-OR的屏蔽作用 ， 故前者较低场； C环氧化程度越高 ， H-2, 6处于越低场的位置 。 2 3, 4-二氧取代黄酮类化合物 5 6 2 O RO RH-2受 C环负屏蔽和 3-OR屏蔽作用 ， H-6 也受 C环负屏蔽作用 ， 而 H-5则仅 4-OR屏蔽作用 。 故由低场到高场的顺
12、序为： H-6 H-2 H-5。 但有时也会发生 H-2和 H-6重叠的现象 。 （ 1） 3, 4-二氧取代黄酮及 黄酮醇 H-5 6.7-7.1 d, J=8.5Hz H-2 7.2 d, J=2.5Hz H-6 7.9 dd, J=2.5, 8.5Hz （ 2） 3, 4-二氧取代异黄酮 、 二氢黄酮及 二氢黄酮醇 H-2, 5,6常作为一个复杂多重峰 （ 通常为两组峰 ） 6.7-7.1 5 6 2 O RO R3 3, 4,5-三氧取代黄酮类化合物 6 2 O R 2O R 1O R 3若 R1=R2=R3=H， 则 H-2,6为单峰 ， 6.7-7.5 若上述条件不成立（如 3或
13、5甲基化或苷化时），则 H-2,6分别为二重峰（ J=2Hz） （三） C环质子 1. 黄酮类 H - 3 , 6 . 33OHO2. 异黄酮类 32OOHH-2位于羰基 位 ， 同时受羰基和苯环的负屏蔽作用 ， 且通过碳与氧相连 ， 故较一般芳香质子低场 ， 7.6-7.8。 若用 DMSO-d6作溶剂，则 8.5-8.7。 3. 二氢黄酮和二氢黄酮醇 1) 二氢黄酮 23OHOH两个 H-3, 分别为 dd峰 ， 中心位于 2.8 ， J = 17Hz（ 偕偶 ） ， 5Hz（ 顺偶 ） 及 J = 17Hz（ 偕偶 ） ， 11Hz（ 反偶 ） H-2, dd, 5.2, Jtrans = 11Hz （反偶） , Jcis = 5Hz（顺偶） （ 2）二氢黄酮醇 32( 2 S , 3 S ) 二 氢 黄 酮OOHO HH3-OH苷化，供电子能力下降，两个氢的 值升高（向低场位移），可用于判断二氢黄酮醇苷中糖的位置。 H-2与 H-3为反 式双直立键， J=11Hz H-2 4.9 H-3 4.3 H- ： 6.50-6.70 ( 1H,d, J=Ca.17.0 ) H- ： 7.30-7.70 ( 1H,d, J=Ca.17.0 ) OHH ?查耳酮： 苄氢 :6.50-6.70( 1H,s )
