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1、第二章林木基因工程本章要点2.1 基因工程的基本知识2.2 植物基因的分离克隆2.3 植物遗传转化2.4 基因工程与林木遗传改良2.1 基因工程的基本知识基因工程遗传工程，重组 DNA技术 (DNA recombination)是指采用分子生物学手段，将不同来源的基因，按照人类的愿望，在体外进行重组，然后将重组的基因导入受体细胞，使原有生物产生新的遗传特性，获得新品种，生产新产品的技术科学。可以跨越天然物种屏障，把来自任何一种生物的基因导入到新的生物中，实现不同生物的基因重组或基因转移，达到对某种生物个别性状遗传改良的目的。是现代生物技术的核心和支柱。基因组某种生物体或一个细胞所携带的全部DN
2、A序列的总和。狭义的基因组（ genome）是专指核基因组。广义的基因组还包括叶绿体基因组和线粒体基因组。核基因组是指维持生物体完整生命功能所必须的1 组染色体或配子体（性细胞）所包含的全部DNA序列（nDNA ）。一个生物物种单倍体基因组的DNA含量称为该物种的C 值，每一个生物物种的C值是恒定的，一般用pg或碱基对表示。 1pg=10-12g，相当于31cm长的DNA排列，约10 9bp。 叶绿体基因组叶绿体是植物进行光合作用的场所，叶绿体中含有独立于核基因组以外的叶绿体基因组，称为cpDNA 。一个植物叶片细胞通常含有数百个叶绿体，一个叶绿体中含 20-80个 cpDNA拷贝。银杏的叶绿
3、体基因组为 158kb。 线粒体基因组线粒体是动植物细胞将有机物质氧化降解成水和二氧化碳、并释放出能量的细胞器。也含有独立于核基因组以外的基因组，称为线粒体基因组，其DNA称为线粒体基因组DNA（mtDNA）。植物的线粒体基因组比动物要大得多。 植物线粒体基因组含有数目不等的内含子序列。基因指编码功能蛋白质或 RNA分子所必须的DNA序列或RNA 序列，是遗传的功能单位，可产生或影响某种表型。一般又可分为结构基因 (structure gene)：编码蛋白质（或RNA）调控基因 (control gene)：调控结构基因的表达。通常指结构基因。 真核基因的结构2.2 目的基因的克隆2.2.1
4、基因克隆的工具酶2.2.2 基因克隆的载体2.2.3 基因克隆的方法2.2.1基因克隆的工具酶限制性内切核酸酶 restriction endonucleaseDNA连接酶 DNA ligaseDNA聚合酶 DNA polymerase反转录酶碱性磷酸酶S1核酸酶末端脱氧核苷酸转移酶2.2.1.1 限制性内切核酸酶限制作用：一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用，破坏入侵的外源DNA（如噬菌体DNA），使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制。修饰作用：生物细胞自身的DNA分子通过修饰酶的作用，在碱基中特定的位置发生了甲基化，而得到修饰，可免遭自身限制性酶的破坏。2.2.1.1 限制性内切核酸酶主
5、要有 I 型、型、型。 型运用最广泛，I 型和型应用极少。I型目前发现的只有EcoB和EcoK两种， 型目前已知的主要是EcoPI和EcoP15。(1)型限制性内切核酸酶的特点能够识别特异性的DNA识别位点，这种识别位点通常具有双链回文对称的结构；切割后形成的双链DNA分子能够彼此互补，并能够重新连接；切割和修饰功能由两种不同的酶催化完成；切割不需要ATP和SAM（硫腺苷甲硫苷酸）作为活性催化因子。（2 ）命名和分类利用属名的第1 个字母和种名的前 2个字母代表内切酶的来源。例如，来自大肠杆菌( Escherichia coli)的内切酶用 Eco来命名，来自流感嗜血菌（Haemophilus
6、 influenzae）的用Hin表示。第4个字母表示酶来源的菌株和菌型。例如，EcoRI中的R表示该酶来自大肠杆菌的R菌株。在同一菌株分离获得的不同内切酶按照分离时间的先后，以罗马数字加以标注，如HindI、Hin d、Hind。（3 ）影响因素DNA的浓度和质量-最关键的因素。酶切消化的缓冲液。酶切反应的温度。其它因素。（4 ）应用构建重组的DNA分子。探针准备。DNA物理图谱构建。DNA甲基化分析。2.2.1.2 DNA聚合酶作用：将脱氧核糖核酸连续地连接到双链DNA分子的3 -OH末端，催化核苷酸的聚合作用，形成长链的核酸分子。(1) 大肠杆菌DNA聚合酶I、Klenow酶大肠杆菌 D
7、NA聚合酶 I 的作用：DNA缺口平移，制备DNA探针。用于DNA序列分析。Klenow酶的主要用途：DNA放射性标记。合成cDNA的第2链。补平内切酶切割双链DNA分子形成的粘性末端。DNA测序。（2）T4 DNA聚合酶具有53DNA聚合活性和35 外切核酸酶活性。其35 外切核酸酶活性比Klenow 酶强200 倍。主要作用：限制性内切酶的末端补平；标记探针；切平双链的DNA末端。（3 ）T7 DNA聚合酶持续合成能力强，催化合成的DNA片段比其它聚合酶催化合成的长得多。具有很强的35 外切核酸酶活性，为Klenow酶的1000 倍。主要用于长片段DNA的合成，也用于DNA分子的快速末端标
8、记。测序酶：经过修饰，失去了35 外切核酸酶活性的 T7 DNA聚合酶。（4 ）TaqDNA聚合酶从极度嗜热的嗜热水生菌Thermus aquaticus中获得，能在94 高温环境中存活3小时以上。具有DNA聚合酶活性和 53外切核酸酶活性。最佳聚合温度在72 80。常用于PCR (polymerase chain reaction，聚合酶链式反应) 扩增。（4 ）TaqDNA聚合酶影响 TaqDNA聚合酶扩增反应的主要因素：模板DNA浓度。25l的反应体系中10 50ng双链DNA 。引物结构及浓度。引物长度一般1030bp ，一对引物扩增的片段在2003000bp 。引物浓度10 50mm
9、ol/L。Mg 2 浓度。1.52.5mmol/L。退火温度。因引物而异，一般引物5060最佳。缓冲液；TaqDNA聚合酶的浓度和用量。（5 ）RNA 反转录酶以 RNA单链为模板，通过 DNA聚合作用形成复合双链 cDNA。目前主要有2 种，AMV和M-MLV，均无3 5外切核酸酶活性。（6 ）DNA 连接酶、RNA 连接酶DNA连接酶连接双链 DNA。已知的有2 种（大肠杆菌DNA连接酶和T4 DNA连接酶）。前者需要NAD 参与催化，不需要 ATP作为能量；后者同时需要NAD 与ATP。二者可催化粘性末端及平末端的连接反应。不能催化单链DNA的连接。单链DNA或RNA的连接可使用T4 R
10、NA连接酶。（7 ）其它酶类末端转移酶、碱性磷酸化酶、S1核酸酶、BAL31核酸酶、核糖核酸酶A、脱氧核糖核酸酶I、外切核酸酶，等等。末端转移酶 : 将脱氧核糖核酸分子按照53方向逐个加入到线性DNA分子末端的一种酶类。用途：同聚物加尾；3末端标记。碱性磷酸化酶 : 将5末端的磷酸基团转换为OH，即脱磷酸作用。2.2.2 基因克隆的载体载体(vector)：在基因工程中，用于携带外源基因进入受体细胞的运载工具。载体本身是DNA。载体的基本条件：含有1个或多个克隆位点，供外源DNA片段的插入到载体上。能进行自我复制，或外源DNA片段能够整合到染色体上，随染色体而进行复制。具有选择标记。安全，对受
11、体细胞无害。分子量小，多拷贝，易于操作。2.2.2 基因克隆的载体载体种类：质粒载体噬菌体载体（包括以噬菌体和质粒为基础构建的Cosmid载体）人工染色体载体（YAC、BAC、PAC、TAC ）(1) 质粒载体质粒是存在于宿主细胞染色体外的一种裸露的双链DNA分子。多呈闭合环状，也有例外。商业化的质粒载体一般 35kb 长。目前已有上百种，如常用的 pUC18/19。(2) 噬菌体载体噬菌体是以大肠杆菌为宿主的病毒，具有极高的感染能力，能够专一性的重组整合到大肠杆菌的染色体上，以原噬菌体的形式长期潜伏在大肠杆菌中。噬菌体载体实际可插入的片段长度可达20kb。主要用于cDNA 文库构建。(3)
12、Cosmid载体结合了噬菌体载体和大肠杆菌质粒载体的优点，本身片段小，但装载能力大，可插入15-45kb ，可用于基因组文库的构建。(4) 噬菌粒(Phagemid)载体也是在噬菌体载体和大肠杆菌质粒载体基础上发展起来的。与Cosmid载体有许多相似之处，如分子量更小。(5) 人工染色体载体酵母人工染色体（YAC， yeast artificial chromosome），最大优点是能够插入较大的外源片段，可达2000kb。细菌人工染色体（BAC），穿梭细菌人工染色体（BIBAC ）。P1人工染色体（PAC），可转基因人工染色体（TAC）。不同类型载体比较2.2.3 基因克隆的方法2.2.3.
13、1 基因文库构建与基因克隆2.2.3.2 已知基因产物的基因克隆2.2.3.3 图位克隆2.2.3.4 差示克隆2.2.3.1基因文库的构建与基因克隆（1 ）基因文库的概念基因文库（ gene library）：某生物类型全部基因的集合。这种集合是以重组体形式出现。某生物DNA片段群体与载体分子重组，重组后转化宿主细胞，转化细胞在选择培养基上生长出的单个菌落(或噬菌斑，或成活细胞) 即为一个DNA片段的克隆。全部DNA 片段克隆的集合体即为该生物的基因文库。2.2.3.1基因文库的构建与基因克隆构建基因文库的意义：使生物的遗传信息以稳定的重组体形式贮存起来。是分离克隆目的基因的主要途径。对于复
14、杂的染色体 DNA分子来说，单个基因所占比例十分微小。要想从庞大的基因组中将其分离出来，一般需要先进行扩增，所以需要构建基因文库。在很多情况下目的基因的分离都离不开基因文库。基因文库也是复杂基因组作图的重要依据。2.2.3.1基因文库的构建与基因克隆（2）基因组文库与 cDNA文库基因组文库：将某生物的全部基因组DNA切割成一定长度的DNA片段克隆到某种载体上而形成的集合。根据DNA来源，又有核基因组文库、叶绿体基因组文库及线粒体基因组文库。cDNA文库：某生物某一发育时期所转录的mRNA 经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。区别：cDNA文库有时效性。2.2.3.1基
15、因文库的构建与基因克隆（3 ）构建基因文库的基本程序-植物 DNA提取及片段化，或是 cDNA的合成。-载体的选择及制备。-DNA片段或cDNA与载体连接。-重组体转化宿主细胞。-转化细胞的筛选。2.2.3.1基因文库的构建与基因克隆（4 ）基因组文库必须符合以下要求：a）能够覆盖整个基因组。b）插入的片段比较大。c）文库比较稳定，且易于保存和操作。 2.2.3.1基因文库的构建与基因克隆（5 ）植物cDNA文库构建克隆载体：主要是质粒及噬菌体。步骤： 细胞总RNA提取，并分离纯化出mRNA； 合成cDNA第一链； 将mRNA-DNA 杂交分子转变成双链cDNA； 双链cDNA重组到载体上。前3步为cDNA合成，第步为cDNA克隆。 用插入型噬菌体载体构建cDNA文库的流程 2.2.3.1基因文库的构建与基因克隆（6 ）基因文库筛选方法核酸杂交法；免疫学检测法；DNA同胞选择法；PCR筛选法；其他方法。2.2.3.2已知基因产物的基因克隆以氨基酸序列为基础的基因克隆方法是最为经典的方法。通过对表达的或者差异表达的蛋白质分子的序列进行测定分析，获得该蛋白质的一段氨基酸的序列。根据编码不同氨基酸的密码子设计
