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1、分析辣椒素对 PP-糖蛋白 (P-gp)是限制药物从血液循环进入脑和从肠腔进入上皮细胞的重要转运蛋白1，故联合使用 P-gp 抑制剂可以增加药物经肠道吸收。Hamilton 等首次发现维拉帕米、环孢菌素 A(CsA)能与化疗药物竞争性结合 P-gp，逆转大肠癌耐药性(MDR) ，但其心肾毒性及免疫抑制作用明显，限制了临床应用。近年来，一些植物化学和本草纲目中的药物，也发现具有抑制 P-gp 功能的作用，如本派丙烷和姜黄，与合成的抑制剂相比它们具有更低的毒性。我们经常食用的辣椒中所含的主要成分辣椒素(CAP)也表现出对 P-gp功能的抑制作用。体外结肠癌 Caco-2 细胞实验发现，辣椒素能够抑
2、制 P-gp 对地高辛的外排作用。由于众多实验结果均是采用细胞研究获得，由于细胞的一些形态学和生理学的局限性，并且 P-gp 在肠道中的分布是不均匀的，因此采用细胞无法预测药物对不同肠区段粘膜上 P-gp 的影响，所以我们采用 Ussing chamber 法分别研究了辣椒素对空肠、回肠和结肠粘膜上 P-gp 功能的影响，并用荧光素钠(CF) 作为细胞旁途径药物转运方式的标志物进行检测。1 材料和方法材料试剂 辣椒素(批号：048K5058V)，Hepes( 批号：016K54331)，Trizma base(批号：103K5411) ，罗丹明 123(批号：046K3688)、荧光素钠(批号
3、：047K0676)均购于 Sigma-Aldrich 公司(St. Louis，MO ，USA)。甲醇和乙腈为 HPLC级别，购买自德国莫克公司。仪器 荧光分光光度仪 (美国 Waters 公司，型号为474);P13110S 电子天平，德国 Sartorins 生产;7 mlUssing chamber 装置( 美国 Harvard 公司) 。 动物 SD 大鼠，雄性，体质量 25020 g，购于南方医科大学实验动物中心，合格证号：SCXK 粤 2006-0015。动物实验的方法符合南方医科大学实验动物伦理委员会的有关规定和要求。方法药物溶液配制Hepes-Tris 缓冲液的配制 取 He
4、pes 6 g 溶于 800 ml 蒸馏水中，使之完全溶解。通入混合气体(95% O2，5% CO2)10 min 后，加入 ml KCl(3 molL-1)、 mlCaCl2(1 molL- 1)、 ml MgSO4(1 molL- 1)、 gNaCl，完全溶解后用TrisRONGYE(1 mol L-1)调节 pH 至，再加入 5 ml 葡萄糖溶液(1 molL-1) ，用蒸馏水稀释至 1000ml，混匀即得。实验溶液配制 分别将辣椒素与 R123 或 CF 溶解在 pH 的 O2/CO2 气体饱和的 Hepes-Tris 缓冲液中，这种Hepes-Tris 溶液每天制备，实验用辣椒素质量
5、浓度为60mgL-1，R123 或 CF 最终质量浓度均为 4mgL-1。 体外 Ussing chamber 实验 SD 大鼠禁食 1618 h，3%戊巴比妥钠(12 ml kg-1)腹腔注射麻醉，延腹中线将腹部切开，取出空肠、回肠和结肠。分别用生理盐水清洗干净，置入冰浴的 Hepes-Tris 缓冲液中通混合气(95% O25% CO2)培养。剪取空肠适量，于冰浴板上迅速剥离浆膜侧的浆膜层，将肠粘膜固定于扩散池上，回肠及结肠的操作方法与空肠相同。在扩散室加入 7 mlR123 或 CF 与 CAP 的混合液，接收室加入 7 ml Hepes-Tris 缓冲液(均预热至 ); 保温，并通入混
6、合气体。分别于 15、30、45、60、75、90和 120 min 在接收室取样 ml，并同时补充相同体积相同温度的 Hepes-Tris 缓冲液。定量方法的建立R123 和 CF 的测定方法学考察 R123 的激发波长为 485 nm，发射波长为 535 nm，可在此波长下测定 R123 的荧光强度，空白无干扰，其荧光图谱如图 1。R123 在(500)g L- 1，荧光强度对浓度进行回归，标准曲线回归方程为：Y=，R2=， Y 为吸光度，X 为浓度。回收率和日内精密度分别为%和%。CF 的激发波长为 480 nm，发射波长为 520 nm，可在此波长下测定 CF 的荧光强度，空白无干扰，
7、其荧光图谱如图 2。CF 在(500)gL-1，荧光强度对浓度进行回归，标准曲线回归方程为：Y=+，R2=，Y 为吸光度，X 为浓度。回收率和日内精密度分别为%和%。 统计学分析计量资料统计结果用均数标准差表示。所有实验数据均采用 SPSS 统计软件进行显著性检验，各组中分泌方向累计透过率与吸收方向累计透过率的比较用重复测量数据的方差分析;各组间不同方向，不同分组的Papp 比较用析因设计资料的方差分析。显著性标准为。2 结果辣椒素对 R123 体外经肠粘膜透过的影响考察辣椒素与 R123 对空肠、回肠和结肠粘膜透过吸收方向(M-S)和分泌方向(S-M)的经时透过变化 (图 35)。计算得到c
8、apsaicin 组 R123 的 M-S 及 S-M 方向的表观渗透系数Papp(10-6cm s-1)，与 control 组对比，表明 R123 对空肠粘膜吸收方向和分泌方向的透过均受到辣椒素的影响。但对R123 经回肠和结肠粘膜吸收方向和分泌方向的透过均未受到辣椒素的影响。辣椒素对 CF 体外经肠粘膜透过的影响考察辣椒素与 CF 同时进行肠粘膜透过时，对 CF 经空肠、回肠和结肠粘膜 M-S 方向和 S-M 方向透过的表观渗透系数 Papp 影响见图 6。计算得到 capsaicin 组 R123 和 CF 的 M-S 及 S-M 方向的表观渗透系数 Papp(10-6cm s-1)，
9、与空白组对比，CF 经空肠粘膜吸收方向和分泌方向的透过均受到辣椒素的影响。然而，辣椒素对 CF 在经回肠和结肠粘膜透过过程中并未出现影响。 3 讨论P-gp 作为一种能量依赖性药物外排泵，大部分位于肠细胞顶侧膜，能将粘膜端的药物泵出到肠腔，即如文中所述的分泌方向，从而降低药物的吸收，这是导致人体药物耐药的重要原因。R123 是 P-gp 经典底物，因其具有荧光特性，检测方便，现在国际上用于评价 P-gp 功能活性研究。有研究表明，P-gp 及其相应基因 Mdr1 在肠道内的分布，其表达量沿肠腔从空肠到结肠逐渐升高，这与前期 Ussing Chamber 实验中证实 R123 在小肠中转运以分泌
10、为主结果相符，因此选择 R123 作为研究辣椒素对 P-gp 经肠透过影响的指示药物。CF 与 R123 转运机制不同，通过细胞旁途径透过肠粘膜，广泛用作细胞旁途径药物转运方式标志物应用于实验中，具有可见光范围的荧光。用 CF 作为对照，更能完善实验内容，辅证实验结果。目前 Ussing Chamber 扩散池法被认为是研究底物透膜转运行为的标准方法，应用Ussing Chamber 模型获得药物的 Papp 与人口服吸收分数之间存在良好相关性，具有模拟为肠道环境的特点，操作简单，成本较低，易于推广，作为生物药剂学研究的新方法，近年在国外应用较多，特别为肠段的分段定位研究提供有效研究手段。由于
11、药物吸收是从肠腔先透过至粘膜层的上皮细胞，而后再到固有层，固有层存在很多微血管和淋巴细胞，药物在此能被吸收如血液循环，导致很小的一部分透过粘膜肌层。因此，需要分离除去肠粘膜上的肌层组织，这是Ussing Chamber 实验法的难点及技术关键。在亚洲，辣椒是一种广为使用的调味品，尤其在东南亚地区，辣椒素在食谱中占据很大比重，辣椒在血浆中含量可达到 825 mol/L。因此，体内辣椒素可能通过影响肠道内 P-gp 功能，而对同服的某些 P-gp 底物药物( 如环孢素等)在肠道内透过吸收产生影响，尤其是对于治疗窗较窄，易受 P-gp 外排严重影响的药物。实验使用体外 UssingChamber 技
12、术考察辣椒素对 R123 经空肠、回肠和结肠粘膜吸收(M-S)方向和分泌(S-M)方向的影响，发现经空肠粘膜透过时，R123 的 M-S方向与空白组相比显著增高，S-M 方向显著降低，表明R123 经空肠粘膜 M-S 方向和 S-M 方向的透过均受到辣椒素的影响，而回肠及结肠粘膜透过时，M-S 组及 S-M 组表观渗透系数 Papp 与空白组相比均没有显著性差异，说明辣椒素在空肠透过时抑制了 P-gp 的功能，改变了 R123 经空肠粘膜的透过性。而辣椒素在回肠和结肠对 R123 的透过没有影响，这可能跟 P-gp 及其相应基因 Mdr1 在肠道内的分布表达量沿肠腔从空肠到结肠逐渐升高有关，因
13、此对于空肠粘膜上的 P-gp 蛋白影响更剧烈，而对于回肠及结肠粘膜上的 P-gp 可能需要更高浓度的辣椒素才能够发挥作用。同时，为了辅证旁细胞途径是否影响药物转运，选用 CF 作为标志物进行检测。经空肠粘膜透过时，M-S 组及 S-M 组分别与空白组相比，均具有显著性差异;经回肠和结肠粘膜透过与空白组相比没有显著性差异，提示辣椒素仅对空肠粘膜上旁细胞通路有影响，却并没有改变回肠和结肠肠粘膜上紧密连接的状态。有研究表明，P-gp 表达量沿肠腔从空肠到结肠逐渐升高，而辣椒素仅在空肠中显示出对 R123 透过的影响，暗示辣椒素可能是一种较弱的 P-gp 抑制剂。肠道中紧密连接也呈现相似的表达情况，辣
14、椒素对于 CF 的透过增强作用同样只存在于空肠，表明辣椒素对药物吸收主要部位空肠具有粘膜改善作用。因而，喜爱食用辣椒的患者在使用 P-gp 底物类药物和经旁细胞通道转运吸收药物时，其体内药物吸收情况值得关注。有关辣椒素对肠粘膜上 P-gp 影响的体内 In situ 大鼠实验正在进行中。因此，辣椒素抑制 P-gp功能从而影响 P-gp 底物 R123 经肠粘膜透过的作用具有肠段差异性，对 R123 和 CF 的影响仅仅存在于空肠，而在回肠和结肠却影响很小，这可能与 P-gp 和紧密连接在肠粘膜上的分布是从空肠到结肠逐渐变化的分布有关。实验结果与传统意义上服药要忌辛忌辣有矛盾。本实验思路能为后续研究 ABC 外排转运体提供指导，而且能为临床用药提供更可靠的理论依据。
