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1、1. 小鼠 ES 细胞培养：ATCC实验材料：配制格拉斯哥极限必须培养基（GMEM） ，外加 15% 热失活牛胎血清、55L GIBCO（-巯基乙醇） 、2mM L-谷氨酰胺、 0.1mM MEM 非必需氨基酸 5000 unit/ml 青霉素和 1000 unit/ml ESGRO (Chemicon)。培养饥饿处理的小鼠 E14Tg2A ES 细胞。2.TET 1 knockdown：（1 ）使用试剂盒（Lipofectamine RNAiMAX）将 siRNA（CONT KD、TET1 KD1、TET1 KD2）制成脂质体后转染进受体细胞。 （用 Opti-MEM 分别稀释 RNA分子和
2、 Lipofectamine RNAiMAX，将两者混合，室温下孵育 10-20 分钟。加入培养细胞中，在 37°C 孵育 24-48 小时） （ 2）每种细胞各取 20ml 在培养皿中于 37，5CO2，100湿度条件下培养培养。*3.挽救实验：如步骤 2 将 mrna 转入基因敲除细胞，3.培养 24hs 后，收集培养细胞培养细胞并提取蛋白质4SDS-PAGE 分离表达蛋白（1 ）电泳胶准备a.安装制胶板b按下表配制 10%分离胶:丙烯酰胺 10% ddH2O/Ml 4.030%酵母液 /mL 2.5分离胶缓冲液（pH8.8）/mL 0.910%SDS/L 7510%APS/L
3、65TEMED/L 5c.将配置好的分离胶加入制胶槽中，注意应随边缘缓慢加入，勿进气泡，凝胶液价值约距前玻璃板 1.5cm 处。d轻轻在分离胶溶液上覆盖一层双蒸水封胶，是凝胶表面平整，静放 30min 后除去上层水层，滤纸吸去残留液体。e配制 5%浓缩胶（3mL）丙烯酰胺 5% dd 离子水/mL 2.130%酵母液 /Ml 0.5 浓缩胶缓冲液/mL 0.3710%SDS/L 2510%APS/L 25TEMED/L 5f迅速将配置好的浓缩胶加到分离胶上面，并插入梳子至凝胶内，是梳子尺底部与前玻璃板顶端平齐，小心避免混入气泡，静置 30min。（2 ）电泳a将胶板放入电泳槽中，在上下电泳槽中
4、添加 1X 电极缓冲液，使凝胶上下端均浸泡在缓冲液中，缓缓拔出梳子后上样。b接通电源，上样孔端接负极，另一端接负极，起始电压 80V。待溴酚蓝进入分离胶时，电压跳到 110V。5.Western Blotting 检测目的蛋白及含量（Actin,OCT4, SOX2,TET1）实验试剂：电转液：25mmol/L Tris、192mmol/L Ala、20%(V/V)甲醇一抗：His·Tag 抗体或鼠抗人 GM-CSF 单克隆抗体二抗：HRP 标记的羊抗鼠 IgG·12H2O、0.2%KH2PO410Xpbs:8%NACl、0.2KCl ，0.29%NaHPO4PBST:1X
5、pbs,0.01%-0.02%Tween-20TBST:20mmol/L Tris-Hcl(pH7.4)、150mmol/L Nacl、0.05%Tween-20封闭液：含 5%脱脂奶粉的 PBST 或 TTBS（临时用 200mLPBST 或 TBST 加入 10g脱脂奶粉）显色液或发光液实验用具：垂直板电泳槽，Bio-Rad 公司的电转移装置，稳压横流电泳仪，PVDF 角切去一块作为标记，小心从制胶板上将凝胶剥下，去浓缩胶。用电转液漂洗 10-15min。（2 ）转膜（半干法）a将膜泡入甲醇中 1-2min 后转入电转液中，将合适的靠胶滤纸和靠膜滤纸分别泡入电转液中。b电转移夹层的组装在电
6、转仪上铺好三层滤纸剪去膜左上角，将膜铺在靠膜滤纸上，注意不要产生气泡，倒些电转液到膜上，保持其湿润。将胶移到膜上后，用一张靠膜滤纸覆盖在胶上。倒些电转液，铺两张靠膜滤纸。c装好电转仪，100mA/膜，转移 1.5h。（3 ）封闭与杂交a封闭：转移结束后，将膜取出，用去离子水与 PBST 稍加漂洗，浸没于封闭液中。室温下 70r/min 孵育 1h。b结合一抗：将膜 1:500 稀释的一抗溶液中，室温下 70r/min 孵育 2h。c洗涤：用 PBST 漂洗三次，每次 5-10min。d结合二抗：按相应比例稀二抗后，将膜浸入二抗溶液中，室温下 70r/min 孵育 1h。e用 PBS 洗膜 1-
7、3 次。（4 ）发光与显色鉴定 HRP-ECL 发光法a将 A、B 发光液按比例稀释混合。b膜用 ddH2O 稍加漂洗，滤纸贴脚吸干。c.将混合物覆盖在膜表面，1-2min，并摇晃混匀。d.熄灯可见淡绿色荧光条带后滤纸贴脚吸干，用保鲜膜把膜包起来，放入片盒。e在暗室中将 X 光片覆盖在上面，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。f取出胶片后立即进入显影液中 1-2min，清水漂洗后放入定影液至完全定影。清水冲净晒干，标定 marker 后进行分析与扫描。arget sequences of shRNA(DNA)Gene Name Target sequenceControl CONT KD 5-GT
8、TCAGATGTGCGGCGAGT-3Tet1 KD1 5-GCAGATGGCCGTGACACAAAT-3Tet1 KD2 5-GCTCATGGAGACTAGGTTTGG-3RNA:Control CONT KD 3-CAAGTCTACACGCCCGCTCA-5Tet1 KD1 3-CGTCTACCGGCACTGTGTTTA-5Tet1 KD2 3-CGAGTACCTCTCATCCAAACC-5Antibody：TET1 AbcamSOX2 GeneTex OCT4 AbcamMillipore美国 Chemicon 公司的专利产品 ESGRO®与 LIF 是享誉全球的干细胞培养产品。 LIF 全称是白血病抑制因子，ESGRO®主要成分是含有优化了浓度与活性的重组鼠白血病抑制因子（mLIF ） ，当用于培养时，能高效抑制干细胞的自发分化从而维持鼠源干细胞多潜能的表型。
