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1、微 生 物 学 通 报 SEP 20, 2008, 35(9): 13671372 Microbiology 2008 by Institute of Microbiology, CAS 基 金 项 目 ： 国 家 “863 计 划 ”(No. 2006AA09Z434); 国 家 自 然 科 学 基 金 (No. 30670043)资 助* 通 讯 作 者 ： Tel: 021-25070303; : 收 稿 日 期 ： 2008-02-18; 接 受 日 期 ： 2008-03-14研 究 报 告产 Macrolactins 的海洋细菌 X-2 中型PKS 基因簇的筛选鉴定与功能分析董
2、晓 毅 王梁 华 孙铭 娟 宗 英 焦豫良 焦炳 华 *(中 国 人 民 解 放 军 第 二 军 医 大 学 基 础 医 学 部 生 物 化 学 与 分 子 生 物 学 教 研 室 上 海 200433)摘 要 : Macrolactins 是 近 年 来 从 Actinomadura sp.和 Bacillus sp.等 海 洋 来 源 的 微 生 物 中 分 离 的 一群 24 元 大 环 内 酯 类 化 合 物 , 具 有 抗 菌 、抗 病 毒 和 抗 肿 瘤 等 生 物 学 活 性 。本 室 从 东 海 海 泥 中 分 离 到一 株 海 洋 细 菌 X-2, 可 产 生 多 种 Mac
3、rolactins。本 研 究 自 行 设 计 了 一 套 针 对 型 聚 酮 合 酶(polyketide synthase, PKS)基 因 中 酮 缩 合 酶 (ketosynthase, KS)片 段 的 简 并 引 物 , 使 用 PCR 方 法 直 接克 隆 到 了 X-2 基 因 组 中 的 一 段 长 约 645 bp 的 型 KS 基 因 片 段 , 提 交 GenBank 获 登 录 号EF486351, 并 以 之 为 探 针 筛 选 X-2 的 fosmid 基 因 组 文 库 , 得 到 了 3 个 阳 性 克 隆 , 测 序 获 得 的 序 列经 同 源 性 分 析
4、 和 功 能 预 测 , 初 步 证 实 获 得 了 该 菌 中 负 责 生 物 合 成 Macrolactin 的 部 分 型 PKS 基因 簇 的 功 能 序 列 。关 键 词 : Macrolactin, 聚 酮 合 酶 , 枯 草 芽 孢 杆 菌Screening, Identifying and Function Analysis of Polyketide Synthase I Cluster from the Environmental Strain X-2 Which Produce Macrolactins DONG Xiao-Yi WANG Liang-Hua SUN Mi
5、ng-Juan ZONG Ying JIAO Yu-Liang JIAO Bing-Hua*(Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Basic Medical Science, Second Military Medical University, Shanghai 200433)Abstract: Macrolactins are 24-membered macrolides produced by unidentified marine bacterium, Actinomadura sp. and Bac
6、illus sp., which exhibit both antibacterial and antitumor activities in vitro. The environmental strain X-2 which was isolated from the sediment of the East China Sea produce Macrolatin A, B and O. In this study, a set of degenerate oligonucleotide primers, designed for amplification ketosynthase(KS
7、) domains, had been employed to identify KS gene fragments of the X-2 DNA samples. One 645 bp KS fragment(GenBank accession no. EF486351)had been cloned and used as a probe to screen the genome DNA fosmid library of X-2. Three positive clones were selected and sequenced, Homologous analysis and the
8、function prediction of the obtained PKS gene fragments suggested that macrolactin is the 1368 微 生 物 学 通 报 2008, Vol.35, No.9http:/ Biosynthesis Product of the gene cluster obtained in the environmental strain X-2.Keywords: Macrolactin, Polyketide synthase, Bacillus sp.利 用 组 合 生 物 学 手 段 对 不 同 来 源 的 次
9、 级 代 谢 产物 的 生 物 合 成 基 因 进 行 重 新 设 计 和 组 合 , 产 生 大 量具 有 新 的 药 效 的 “非 天 然 ”药 物 是 新 药 开 发 的 新 方 向 。但 这 些 工 作 的 前 提 条 件 是 次 级 代 谢 产 物 生 物 合 成 基因 (簇 )的 克 隆 与 功 能 分 析 1。Macrolactins 是 一 类 24 员 大 环 内 酯 类 化 合 物 , 具 有 抗 菌 、抗 病 毒 和 抗 肿 瘤 等 多 种 生 物 学 活 性 , 近年 来 又 发 现 其 可 有 效 抑 制 鲨 烯 合 酶 的 活 性 , 提 示 其可 作 为 胆 固
10、醇 合 成 的 抑 制 剂 2。目 前 Macrolactins已 经 有 18 个 家 族 成 员 (Macrolactin A R)3,4,68, 主要 来 自 海 洋 来 源 的 Actinomadura sp.和 Bacillus sp., 在 陆 地 土 壤 中 的 Streptomyces sp.中 也 有 发 现 2。海 洋 细 菌 X-2 是 本 实 验 室 从 我 国 东 海 海 底 沉积 物 中 分 离 出 的 一 株 革 兰 氏 阳 性 芽 孢 杆 菌 类 菌 株 , 该 菌 产 生 3 种 大 环 内 酯 类 化 合 物 , Macrolactin A、Macrolac
11、tin B 和 Macrolactin O, 其 中Macrolactin O 为 本 实 验 室 首 先 发 现 , A 和 O 的 结 构式 如 图 1 所 示 。本 研 究 以 可 产 生 Macrolactins 的 海 洋 细 菌 X-2为 研 究 对 象 , 通 过 简 并 引 物 PCR 扩 增 方 法 , 获 得 一段 KS 结 构 域 的 DNA 片 段 做 探 针 筛 选 文 库 , 克 隆并 初 步 鉴 定 该 细 菌 中 为 Macrolactins 生 物 合 成 负 责的 型 PKS 基 因 簇 。为 进 一 步 考 察 其 生 物 合 成 基 因功 能 , 最 终
12、 阐 明 Macrolactins 的 生 物 合 成 和 调 控 机理 打 下 基 础 。图 1 Macrolactin A 和 Macrolactin O 结 构 示 意 图Fig. 1 The structure of MacrolactinA and Macrolactin O1 材 料 与 方 法1.1 质 粒 及 菌 种海 洋 芽 孢 杆 菌 X-2、E. coli BL21 为 本 室 保 存 ; 克 隆 测 序 载 体 pMD18-T、工 具 酶 等 购 自 TaKaRa公 司 。1.2 分 子 生 物 学 相 关 试 剂宏 基 因 组 文 库 构 建 试 剂 盒 CopyCo
13、ntrol Fosmid Library Production Kit(CCFOS110, EPICENTRE Technologies), 正 电 荷 尼 龙 膜Magnaprobe Nylon Membranes(HP0HY00010, OSMONICS Inc.), 地 高 辛 杂 交 检 测 试 剂 盒 I(DIGD-110, Innogent), 其 它 试 剂 配 制 和 常 用 试 剂 均 购 自上 海 生 工 , 分 子 生 物 学 操 作 方 法 参 考 分 子 克 隆 第 三版 。1.3 仪 器 设 备脉 冲 场 电 泳 仪 (Pharmacia Biotech), PCR
14、 仪(Perkin Elmer 2400), Shake n Stack 杂 交 炉 (Hybrid), LG-5 真 空 冷 冻 干 燥 机 (上 海 市 离 心 机 械 研 究 所 ), XW-80A 漩 涡 混 合 器 (江 苏 海 门 麒 麟 医 用 仪 器 厂 )。1.4 海 洋 细 菌 X-2 中 型 PKS 相 关 基 因 (簇 )的克 隆1.4.1 基 因 组 DNA 抽 提 ： 考 虑 到 芽 胞 的 存 在 , 细菌 的 裂 解 方 法 必 须 包 括 溶 菌 酶 , 故 使 用 基 于 酶 法 的华 舜 基 因 组 DNA 小 量 提 取 试 剂 盒 提 取 海 洋 细
15、菌 X-2 的 基 因 组 DNA, 操 作 中 保 持 动 作 轻 柔 以 维 持 基 因组 DNA 的 完 整 性 。1.4.2 简 并 引 物 扩 增 KS 片 段 ： 使 用 简 并 引 物 扩 增X-2 的 基 因 组 中 可 能 的 型 PKS 的 KS 结 构 域 的 保守 区 域 ：正 义 引 物 针 对 PQQR 模 序 , 序 列 为 ：5-董 晓 毅 等 : 产 Macrolactins 的 海 洋 细 菌 X-2 中 型 PKS 基 因 簇 的 筛 选 鉴 定 与 功 能 分 析 1369http:/ 反 义 引 物 则 针对 HGTGT 模 序 , 序 列 为 ：5-GTSCCSGTSSCRT GSSHYTCSA-3 (注 ：S: A, G; Y: C, T; R: A, G, C, T)。获 得 的 阳 性 条 带 经 回 收 后 将 其 连 接 到 PMD-18 T 载体 上
