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1、NCBI 在线 Blast 的图文说明（Basic Local Alignment Search Tool）是一套在蛋白质数据库或 DNA 数据库中进行相似性比较的分析工具。BLAST程序能迅速与公开数据库进行相似性序列比较。BLAST 结果中的得分是对一种对相似性的统计说明。BLAST 采用一种局部的算法获得两个序列中具有相似性的序列。Blast 中常用的程序介绍：1、BLASTP 是蛋白序列到蛋白库中的一种查询。库中存在的每条已知序列将逐一地同每条所查序列作一对一的序列比对。2、BLASTX 是核酸序列到蛋白库中的一种查询。先将核酸序列翻译成蛋白序列（一条核酸序列会被翻译成可能的六条蛋白）
2、 ，再对每一条作一对一的蛋白序列比对。3、BLASTN 是核酸序列到核酸库中的一种查询。库中存在的每条已知序列都将同所查序列作一对一地核酸序列比对。4、TBLASTN 是蛋白序列到核酸库中的一种查询。与 BLASTX 相反，它是将库中的核酸序列翻译成蛋白序列，再同所查序列作蛋白与蛋白的比对。5、TBLASTX 是核酸序列到核酸库中的一种查询。此种查询将库中的核酸序列和所查的核酸序列都翻译成蛋白（每条核酸序列会产生 6 条可能的蛋白序列） ，这样每次比对会产生 36 种比对阵列。NCBI 的在线 blast：http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi1，进入在线
3、 blast 界面，可以选择 blast 特定的物种（如人，小鼠，水稻等） ，也可以选择 blast 所有的核酸或蛋白序列。不同的 blast 程序上面已经有了介绍。这里以常用的核酸库作为例子。2，粘贴 fasta 格式的序列。选择一个要比对的数据库。关于数据库的说明请看 NCBI 在线 blast 数据库的简要说明。一般的话参数默认。3，blast 参数的设置。注意显示的最大的结果数跟 E 值，E 值是比较重要的。筛选的标准。最后会说明一下。4，注意一下你输入的序列长度。注意一下比对的数据库的说明。5，blast 结果的图形显示。没啥好说的。6，blast 结果的描述区域。注意分值与 E 值
4、。分值越大越靠前了，E 值越小也是这样。7，blast 结果的详细比对结果。注意比对到的序列长度。评价一个 blast 结果的标准主要有三项，E 值（Expect)，一致性(Identities)，缺失或插入（ Gaps） 。加上长度的话，就有四个标准了。如图中显示，比对到的序列长度为 1405，看Identities 这一值，才匹配到 1344bp,而输入的序列长度也是为 1344bp（看上面的图） ，就说明比对到的序列要长一点。由 Qurey（起始 1）和 Sbjct(起始 35)的起始位置可知，5端是是多了一段的。有时也要注意 3端的。附：E 值（Expect) ：表示随机匹配的可能性，
5、E 值越大，随机匹配的可能性也越大。E 值接近零或为零时，具本上就是完全匹配了。一致性(Identities)：或相似性。匹配上的碱基数占总序列长的百分数。缺失或插入（Gaps）：插入或缺失。用 来表示。附 2： NCBI 在线 blast 数据库的简要说明 本文详细出处参考：http:/liucheng.name/475/Peptide Sequence Databases 蛋白序列的数据库nrAll non-redundant GenBank CDS translations + RefSeq Proteins + PDB + SwissProt + PIR + PRF所有非冗余的的 Ge
6、nBank CDS 区的翻译序列 + 参考序列的蛋白 + PDB 数据库 + SwissProt 蛋白数据库 + PRF 蛋白数据库refseqRefSeq protein sequences from NCBIs Reference Sequence Project.所有 NCBI 的参考序列swissprotLast major release of the SWISS-PROT protein sequence database (no updates).swissprot 的蛋白数据库patProteins from the Patent division of GenPept.专利的
7、蛋白数据库pdbSequences derived from the 3-dimensional structure from Brookhaven Protein Data Bank.PDB 数据库monthAll new or revised GenBank CDS translation+PDB+SwissProt+PIR+PRF released in the last 30 days.一个月内新增加的蛋白序列env_nrProtein sequences from environmental samples.来自 environmental samples 的蛋白序列Nucleoti
8、de Sequence Databases 核酸数据库nrAll GenBank + RefSeq Nucleotides + EMBL + DDBJ + PDB sequences (excluding HTGS0,1,2, EST, GSS, STS, PAT, WGS). No longer non-redundant.所有 GenBank 的核酸序列 + 参考序列中的核酸序列+ EMBL +DDBJ +PDB 核酸序列（但不包括 HTG，EST ，GSS 等序列）refseq_rnaRNA entries from NCBIs Reference Sequence projectNCB
9、I 参考序列中的核酸序列refseq_genomicGenomic entries from NCBIs Reference Sequence projectNCBI 参考序列中的基因组序列estDatabase of GenBank + EMBL + DDBJ sequences from EST Divisions来自 GenBank + EMBL + DDBJ 的 EST 序列est_humanHuman subset of est.人的 EST 序列est_mouseMouse subset.小鼠的 EST 序列est_othersNon-Mouse, non-Human subset
10、 of est.、除了人与小鼠之外的 EST 序列gssGenome Survey Sequence, includes single-pass genomic data, exon-trapped sequences, and Alu PCR sequences.htgsUnfinished High Throughput Genomic Sequences: phases 0, 1 and 2 (finished, phase 3 HTG sequences are in nr)未发布的高通量的基因组测序Primer-BLAST：NCBI 的引物设计和特异性检验工具Primer-BLAST
11、 介绍Primer-Blast，在线设计用于聚合酶链反应（PCR）的特异性寡核苷酸引物。Primer-BLAST 可以直接从Blast 主页（http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/）找到，或是直接用下面的链接进入：http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/这个工具整合了目前流行的 Primer3 软件，再加上 NCBI 的 Blast 进行引物特异性的验证。Primer-BLAST 免除了用另一个站点或工具设计引物的步骤，设计好的引物程序直接用 Blast 进行引物特异性验证。并且，Primer-BLAST 能设计出只扩增某
12、一特定剪接变异体基因的引物an important feature for PCR protocols measuring tissue specific expression（注：没办法准确的翻译，只好作罢，汗！）。Primer-BLAST 有许多改进的功能，这样在选择引物方面比单个的用 Primer3 和 NCBI BLAST 更加准确。Primer-BLAST 的输入Primer-BLAST 界面包括了 Primer3 和 BLAST 的功能。提交的界面主要包括三个部分：target template（模板区）, the primers（引物区）, 和 specificity check
13、（特异性验证区）。跟其它的BLAST 一样，点击底部的“Advanced parameters”有更多的参数设置。模板（Template）在“PCR Template”下面的文本框，输入目标模板的序列，FASTA 格式或直接用 Accession Number。如果你在这里输入了序列，是用于引物的设计。Primer-BLAST 就会根据你输入的序列设计特异性引物，并且在目标数据库（在 specificity check 区选择）是唯一的。引物（Primers）如果你已经设计好了引物，要拿来验证引物的好坏。可以在 Primer Parameters 区填入你的一条或一对引物。并且选择好验证的目标
14、数据库（在 specificity check 区选择）。根据需要可设置产物的大小，Tm 值等。特异性（Specificity）在 specificity check 区，选择设计引物或验证引物时的目标数据库和物种。这一步是比较重要的。这里提供了 4 种数据库：RefSeq mRNA, Genome (selected reference assemblies), Genome (all chromosomes), and nr (the standard non-redundant database)。前两个数据库是经过专家注释的数据，这样可以给出更准确的结果。特别是，当你用 NCBI 的参
15、考序列作为模板和参考序列数据库作为标准来设计引物时，Primer-BLAST 可以设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的特异引物。selected reference assemblies 包括以下的物种： human, chimpanzee, mouse, rat, cow, dog, chicken, zebrafish, fruit fly, honeybee, Arabidopsis, 和 rice。Nr 数据库覆盖 NCBI 所有的物种。实例分析用人尿嘧啶 DNA 糖基化酶(uracil-DNA glycosylase genes, UNG, GeneID: 7374)的两个转录本序列
16、作为一个例子来分析。UNG1 的序列长一点（NM_003362），UNG2 的序列短一点（NM_080911，注：拿这两个基因的序列 ClustalW 一下就可以了）。这里用 UNG2 的序列设计引物，选择 RefSeq mRNA database，物种是 Human，其它默认。结果如下图 A-B 所示，设计的引物只能扩增出 UNG2。看上面的图，把“Allow primer to amplify mRNA splice variants”这个选项给勾上，出现的结果如下图-C所示，新的引物也可以扩增出 UNG1（注：我试了一下，不能得到预期的结果，可能参数没设对）。Figure. Primer-BLAST results for UNG transcript variant 2. The NCBI Reference sequence NM_080911 was used as a template. Top panel: Primers specific to the s
