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1、1脑室内注射胰岛素对大鼠全脑缺血后海马 CA1 区Bcl作者：李兵，章翔，蒋小帆，王彦刚，张戈【关键词】 胰岛素；脑缺血；Bcl摘要：目的 观察胰岛素对全脑缺血后海马 CA1 区 Bcl2 mRNA 含量变化及其蛋白表达的影响，探讨胰岛素保护作用的机制。方法 利用 4VO 法制作大鼠全脑缺血模型。造成脑缺血 15min 后行再灌注 ，治疗组于再灌注后即刻经脑室注入 1u 胰岛素(10L，1105u/L)，缺血组则经脑室注入 10L生理盐水。利用反转录 PCR(RTPCR)、免疫组化及 Westernblot 法分别于全脑缺血后1、3 、5d 观察海马 CA1 区 Bcl2 蛋白表达及其 mRN
2、A 相对含量的变化。结果 全脑缺血后 1、3、5d 治疗组海马 CA1 区可见呈阳性表达的 Bcl2 蛋白，而缺血组海马 CA1 区 Bcl2 蛋白的表达则呈阴性；Westernblot 分析，全脑缺血后 1、3、5d 治疗组海马 CA1 区Bcl2 蛋白电泳条带密度分别为2890.791213.616，3147.396243.561 和2594.834204.736，明显高于缺血组的743.37684.123，804.63764.547 和637.86754.394(P0.01)。全脑缺血后 1、3 、5d 缺血组及胰岛2素治疗组海马 CA1 区 Bcl2 mRNA 相对含量则未见明显差异。
3、结论 全脑缺血后脑室内注入胰岛素可能通过促进海马 CA1 区神经元Bcl2 基因的翻译途径从而促进 Bcl2 蛋白表达，这可能是其对全脑缺血后海马 CA1 区神经元产生中枢直接保护作用的主要机制之一 。关键词：胰岛素；脑缺血；Bcl2The effect of intraventricular administration of insulin on expression of Bcl2 mRNA and protein in rat hippocampal CA1 region following global brain ischemiaABSTRACT: Objective To inv
4、estigate the mechanism of neuroprotective effect of insulin on hippocampal CA1 region, the relatively content of Bcl2 mRNA and the expression of Bcl2 protein in rat hippocampal CA1 region following global brain ischemia were observed. Methods Fourvessel occlusion was used to establish the rat global
5、 brain ischemic model. After 15 minutes brain ischemia, 1 unit insulin (10L, 1105u/L) was injected into the cerebral ventricular immediately post reperfusion in treated group, while, 10L NaCl (90g/L) solution was injected into the cerebral 3ventricular at the same time in ischemic group. The relativ
6、ely content of Bcl2 mRNA and the expression of Bcl2 protein in hippocampal CA1 region had been detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR), immunocytochemistry, and Westernblot, respectively. Results The expression of Bcl2 protein was negative in ischemic group and was positi
7、ve in treated group, in 1, 3, 5 day post brain ischemia. While, Westernblotting analysis showed that the density of electrophoretic strip of Bcl2 protein was 2890.791213.616, 3147.396243.561 and 2594.834204.736 in treated group. It was much higher than that in ischemic group, which was 743.37684.123
8、, 804.63764.547 and 637.86754.394, respectively. But, the relatively content of Bcl2 mRNA had no obvious difference between ischemic group and treated group. Conclusion Intraventricular administration of insulin can improve the expression of Bcl2 protein by up regulating the translation of the Bcl2,
9、 and this may be the main point to achieve the neuroprotective effect on hippocamal CA1 region post global brain ischemia.KEY WORDS: insulin; brain ischemia; Bcl24自 1978 年首次在大鼠脑组织的提取物中发现有胰岛素及其受体以来，一些研究相继发现在其他哺乳动物及人类脑中也具有胰岛素及其受体的存在。胰岛素在中枢神经系统中的作用引起了广泛的注意。在缺血性脑损伤的研究过程中，人们通过动物实验发现，全脑缺血再灌注后使用胰岛素，可减轻神经元的
10、死亡或脱失，且这种作用在使用葡萄糖抵销其降糖作用后并不减弱，表明胰岛素在全脑缺血再灌注过程中可不依赖其外周降血糖作用而发挥神经保护作用。但胰岛素对缺血性脑损伤产生中枢保护作用的详细机理目前仍不甚明了。近年来许多文献报道,脑缺血后神经元的凋亡是缺血造成中枢神经系统损伤的一个重要原因。我们以往的研究证实，胰岛素对缺血性脑损伤具有中枢直接保护作用并可减少大鼠海马 CA1 区神经元的凋亡1。为进一步探讨胰岛素对缺血性脑损伤产生中枢直接保护作用的机理，我们对在脑缺血再灌注后，经脑室内注入胰岛素，对大鼠海马 CA1 区 Bcl2mRNA 相对含量变化及其蛋白表达的影响进行了观察。1 材料与方法1.1 实验
11、动物及分组 采用健康成年雄性 SD 大鼠，共 72 只(清洁级) ，体重 (30020)g，由第四军医大学动物实验中心提供。随机分为 缺血组：缺血再灌注后 1、3 、5d 分别取材，每个时间点12 只。胰岛素治疗组：取材时间点及每个时间点的动物数同缺血5组。1.2 动物模型制作 大鼠经 20g/L 戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射后，俯卧位固定于立体定向架上，于颈后正中第一、二颈椎处，切一长约 1.5cm 切口，剥离颈部肌肉显露第一颈椎上之双侧翼孔后，插入双极电凝镊，烧灼闭塞从中穿行的椎动脉，缝合伤口，置笼喂养。24h 后，同法麻醉，于头顶部皮下插入针状电极，仰卧位固定。分离颈部肌肉，显露
12、双侧颈总动脉，夹闭 30s 后描记脑电变化，以脑电变成直线为模型成功的标准。夹闭 15min 后放开动脉夹，行再灌注。于放开动脉夹后即刻，以前囟后 1.2mm、中线旁开1.5mm 为穿刺点。颅骨钻孔后，用微量加样器垂直进针 3.5mm 穿刺脑室，缺血组注入 10L生理盐水，治疗组注入 1u (10L，1105u/L)速效基因合成人胰岛素(丹麦诺和灵公司)。1.3 血糖测定 各组鼠分别于颈总动脉夹闭前及再灌注后30min、1、2、6 、12 、24h 自鼠尾静脉取血约 50L，用血糖测定仪(Lifescan)测定血糖。1.4 标本采集 于规定时间，麻醉后开胸显露心脏，自左心室插管至主动脉，剪开右
13、心房，经预冷生理盐水冲净血液。每组每个时间点 12 只大鼠，其中 4 只以预冷之 40g/L 多聚甲醛灌注固定2h，断头取脑，前囟处以美兰标记，置 40g/L 多聚甲醛中固定64h，系列脱水，石蜡包埋，冠状切片，收取前囟后 3.8mm 处相邻切片两张(6m)行免疫组化观察； 4 只断头取脑，剥离海马，切取双侧海马 CA1 区组织 100mg，迅速置入液氮保存用于 Westernblot检测。4 只以焦碳酸二乙酯 (DEPC)处理的 0.01mol/L PBS(4)50mL 灌注，冲净血液，冰盒内断头取脑。快速剥离海马，切取双侧海马 CA1 区组织 100mg，立即在干冰上冷冻，保存于-80冰箱
14、。1.5 海马 CA1 区 Bcl2 mRNA 相对含量的测定1.5.1 总 RNA 提取 采用异硫氰酸胍法提取总 RNA。获取的总 RNA 用分光光度计测量纯度及浓度后置-80保存备用。1.5.2 反转录合成 cDNA 在 50L的反应体积中加入 5g总 RNA，10L 反应缓冲液，5L 10mol/L dNTPs，0.5L Rnasin(40u/L)，0.25g oligo(DT)12-18，4L 反转录酶(200u/L)，0.5L 0.1mol/L DTT，置 37 孵育 1h，然后于 65加热 5min，储存于-30。引物设计及合成按照已报道2的 Bcl2 cDNA 设计其相应的特异性
15、引物(引物序列5CACCCCTGGCACTTCTCCTTC3；5CACAATCCTCCCCCAGTT7CACC3，扩增产物长度 303bp)。大连宝生物公司合成。1.5.3 PCR 扩增 在 25L的反应体积中加入合成的 cDNA 0.1g，2.5L 10PCR 缓冲液，2.5L 2mol/L dNTPs，2.5L 25mol/L MgCl2，1L 各引物(pmol/L)， 0.5L Taq DNA 聚合酶(5u/L)。使用 PTC100 PCR 仪进行热循环。循环条件：93 1min，56 30s，72 1min，进行一个循环；93 1min，56 30s，72 1min，进行 32 个循环
16、；72 延伸 8min。取扩增产物10L，经 30g/L 琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色后，用凝胶成像系统进行检测，用 Labworks 软件对各阳性条带的密度进行分析，计算各阳性条带的平均密度值与 actin条带平均密度值之比。1.6 Bcl2 蛋白表达的观察 将获取的切片脱蜡至水，置入枸橼酸钠缓冲液(pH 6.0)行微波抗原修复 10min；冲洗后滴加 3%(体积分数)H2O2 阻断内源性酶 15min，冲洗 5min；滴加 Bcl2 抗体(Stanta Cruz，11000)50L，4孵育过夜，PBS 冲洗，参照SABC 试剂盒说明( 博士德公司) 分别滴加二抗及StreptavidinPeroxidase，DABH2O2 混合液显色，封片，镜下观察。1.7 Westernblot81.7.1 蛋白提取及浓度测定 将收取的脑组织置提取缓冲液中制成匀浆，4
