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1、1胰岛素纳米粒对大鼠实验性糖尿病的降血糖作用作者：杨彩哲，胡家露，徐梁，吴道澄，张学庸 【关键词】胰岛素 关键词: 胰岛素;纳米粒; 糖尿病，实验性 摘要: 目的制备氰基丙烯酸正丁酯胰岛素纳米粒（insulinnanoparticlesINP） ，研究其理化特性，观察 sc 和 po 给药对糖尿病大鼠的降血糖作用.方法用改良的乳液聚合法制备氰基丙烯酸正丁酯胰岛素纳米粒，用透射电子显微镜观察 INP 的大小、形态，用高压液相色谱法（HPLC）测定其包裹率，用 ip 四氧嘧啶制备糖尿病大鼠模型.血糖用快速血糖仪测定.用 t 检验和 2 检验进行统计学处理.结果用改良的乳液聚合法制得的 INP 粒径
2、为（300.5）nm ，包裹率为 95%，给糖尿病大鼠sc30Ukg-1，INP 组 1h 开始起作用， 46h 达峰值，血糖降低 98%，作用持续 24h，而普通胰岛素组 1h 达峰值，最大降血糖幅度为 55%，作用持续 4h.sc20Ukg-1，INP 组 1h开始起作用，46h 达峰值，最大降血糖幅度为 74%，作用持续20h，而鱼精蛋白锌胰岛素组 1h 开始起作用，46h 达峰值，最大降血糖幅度为 41%，作用也持续 20h.给糖尿病大鼠poINP120Ukg-1，1d 后空腹血糖开始下降，3d 效果最2佳，血糖降低 89%，57d 后恢复高血糖，而 po 普通胰岛素组血糖无明显变化，
3、24d 的血糖两组比较相差显著 P0.05）.50Ukg-1 组及 100Ukg-1 组作用持续时间均为 5d，120Ukg-1 组的作用时间为 7d.三个剂量组最大降糖作用均在服药后 3d.120Ukg-1 组与100Ukg-1 组 15d 的 BDGP 相差显著（P0.05 ） ，100Ukg-1 组与 50Ukg-1 组 3d 时的 BGDP相差显著（P0.05 ）.结论胰岛素包入纳米粒后生物活性保存良好，sc 后有缓释作用，po 后有降血糖作用.Keywords:insulin;nanoparticles;diabetesmellitus，experi-mental Abstract:
4、AIMToinvestigatethecharacteristicsofinsulin-nanoparticles（INP）andtheirhypoglycemiceffectontheal-loxan-induceddiabeticrats.METHODSINPwaspreparedbyimprovedemulsionpolymerizationmethods.Theentrap-mentefficiencywasmeasuredbyHPLC.Thediabeticratswereinducedbyipalloxan.RESULTSINPthuspreparedwas（300.5）nmind
5、iameterwithanentrapmentefficiency95%.Subcutaneousl3yadministratedINPtoalloxan-induceddiabeticratsatadoseof30Ukg-1induced98%decreaseofbloodglucoseat46h.Theeffectlastedfor24h.Whereastheregularinsulinhypoglycemiceffectlastedonlyfor23hwiththestrongesthypoglycemiceffectof55%at1h.Subcu-taneouslyadministra
6、tedINPatadoseof20Ukg-1toallox-an-induceddiabeticratsinduced74%decreaseofbloodglu-coseat46handtheeffectlastedfor20h.Theprotaminezineinsulineffectlastedforthesametimewiththestrongesthypoglycemiceffectof41%at46h.WhenasingledoseofINPat120Ukg-1wasgivenintragastrically（orally ）tothediabeticrats，thebloodgl
7、ucosebegantodroponthefirstday，thestrongesthypoglycemiceffect（about89%decreaseofbloodglucose）beingobservedonthethirdday.Thehy-poglycemiceffectwasmaintainedfor45d.After5 7dbloodglucosereturnedtothecontrolvalues.Theregularin-sulinrenderednoeffectonbloodglucoseafterintragastricad-minstration（P0.05 ）.The
8、dose-dependencywasobservedinbothhypoglycemiceffectandmaintainingtimewithdiffer-entdosesoforalINP.CONCLUSIONINPcanpreservethebiological4activitiesofinsulinverywell.Whensubcutaneous-lyadministeredtoalloxan-induceddiabeticrats，INPhasaprolongedhypoglycemiceffect.OraladministrationofINPalsoexertsadose-de
9、pendenthypoglycemiceffectonexperi-mentaldiabetes.INPmightbeofpotentialoraluseforin-sulin. 0 引言 po 胰岛素是糖尿病患者的迫切愿望，也是国内外医药工作者研究的热点之一1-5.胰岛素属肽类药物，po 后易被胃肠道蛋白水解酶降解，故其 po 给药问题一直未能解决 .纳米粒（nanoparticlesNP）是一种直径为 101000nm，活性成份包封、镶嵌或吸附于粒子之上的胶体分散系统6 ，因其具有缓释、靶向性、可提高生物利用度、降低不良反应、可保护肽类药物避免蛋白酶的降解等优点而受到重视7-14 ，制备
10、NP 的材料有明胶、白蛋白、丙烯酰胺、丙烯酸酯等，近年来氰基丙烯酸酯类（AlkylcyanoacrylatesACA）因具有在水介质中快速聚合、毒性低、可生物降解等优点而倍受青睐6.我们用氰基丙烯酸正丁酯（butylcyanoacrylateBCA）作原料，制备了氰基丙烯酸酯胰岛素纳米粒（insulin-nanoparticlesINP） ，研究其特性，观察 po 及 sc给药对四氧嘧啶糖尿病大鼠的降血糖作用. 1 材料和方法 51.1 材料 胰岛素注射液购自上海生化制药厂，四氧嘧啶购自 Sigma 公司，氰基丙烯酸正丁酯购自西安实用胶研究所，SD 雄性大鼠购自第四军医大学实验动物中心，高压液
11、相色谱仪是日本岛津公司产品，GT-4310 型葡萄糖测定仪由桂林医疗电子仪器厂与日本京都株式会社合作生产，JEM-2000EX 型透射电子显微镜是日本产品. 1.2 方法 胰岛素纳米粒的制备采用改良的乳液聚合法制备氰基丙烯酸酯胰岛素纳米粒，主要步骤:取蒸馏水 60mL，加入 0.2g 非离子表面活性剂，普通胰岛素溶液 20mL（40kUL-1） ，适量的a-氰基丙烯酸正丁酯（BCA） ，反应 12h，得到半透明的胶体溶液，即为胰岛素纳米粒胶体溶液.采用电子显微镜负染法观察纳米粒的大小及形态.用 50gL-1 的醋酸铀溶液染色后，用透射电子显微镜观察（放大 4 10 万倍）.胰岛素包裹率的测定用
12、高效液相色谱法. 胰岛素纳米粒用蒸馏水充分透析后，分别取透析前后的胰岛素等体积，用适量的乙腈溶解 INP 至透明的溶液，用高效液相色谱仪测定胰岛素含量.层析柱的填料为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为pH 值 2.0 的 0.1molL-1 磷酸盐缓冲液与乙腈按 7/3 比例混合而成的溶液.胰岛素的标准液用上海生化制药厂生产的胰岛素注射液. 包裹率= 透析后胰岛素浓度/透析前胰岛素浓度100%. 将新制备的胰岛素纳米粒置离心管中，以 15000rmin-1 离心660min，观察纳米粒有无分层、聚结或沉淀的现象.4 放置 5mo 观察有无分层、聚结等现象.体质量约 200g 的 SD 雄性大鼠，购
13、自本校实验动物中心，在本实验室饲养 5d，禁食 24h，饮水不限，ip新鲜配制的 50gL-1 四氧嘧啶生理盐水溶液175mgkg-1，分别于给药后 1，2，3 ，7 和 14d 自尾尖取血测定血中葡萄糖浓度.2wk 后空腹 10h 血糖大于16.7mmolL-1 的大鼠被认为是糖尿病大鼠3.糖尿病大鼠随机分为 3 组，每组 4 只，分别 sc 同等剂量的胰岛素纳米粒（INP） 、普通胰岛素（RI）或鱼精蛋白锌胰岛素（ PZI） ，对照组用等量生理盐水（CONTR）.给药后 1，2h 及其后每间隔 2h 自尾尖取血，测血糖水平，直至血糖全部恢复至用药前水平.每个血糖值换算为血糖下降百分数（bl
14、oodglucosedecreasepercentageBGDP）. BGDP=用药前血糖值-用药后血糖值用药前血糖值100%每组各时间点的 BGDP 用 xs 表示，并用 2 检验分析每组各时间点与对照组比较差异是否显著.糖尿病大鼠随机分为 3 组，每组 8 只，分别用 INP，FI 及生理盐水（ NS）ig. 胰岛素的剂量分别为50，100，120Ukg-1 于给药前、后 24，48h 连续测血糖至给药前水平.每组各时间点的血糖或 BGDP 用 xs 表示，并用 t检验或 2 检验分析每组各时间点血糖是否差异显著. 72 结果 2.1INP 的特性 用改良的乳液聚合法制得的氰基丙烯酸酯胰岛
15、素纳米粒为园形或卵园形，直径约 30nm，形态见 Fig1，用 HPLC 测得的包裹率为 95%.普通的胰岛素及 INP 包裹的胰岛素 HPLC 的洗脱峰出现时间无明显差异.INP 以 15000rmin-1 速度离心 60min 未见分层及沉淀.INP 在 4存放 5mo 未见分层及沉淀等现象. 2.2INP 的降血糖作用 将 INP30Ukg-1 给大鼠 sc 后 1h 大鼠血糖开始下降，4h 达峰值，最大降血糖幅度为 98%，作用持续 24h，于用药后 24h 恢复至用药前水平， sc 未包裹的正规胰岛素30Ukg-1，血糖在用药后 1h 下降幅度最大达 55%，疗效维持 3h，用药后
16、4h 血糖恢复至用药前血糖水平.同样剂量（20Ukg-1）的 INP 和 PZI 给糖尿病大鼠 sc 后，两组的降血糖作用均在 1h 起作用，4 6h 达到最大降血糖作用，但是两组最大降血糖幅度分别为 74%和 41%，差异显著（P0.05，Tab1，2） ，作用持续时间相同约为 20h.给糖尿病大鼠 po 给药 INP120Ukg-1，于服药后 1d 空腹血糖开始下降，3d 作用最强，血糖下降率达 89%， 7d 血糖恢复到给药前水平（Fig2）.po 等量 RI 及生理盐水组血糖无明显变化 .INP 组与 RI8组比较，24d 的血糖差异非常显著（P0.01，Fig2）.不同剂量 INP 给糖尿病大鼠 po 后的降血糖作用结果见 Tab3.表1INPsc30Ukg（略）表 2INPsc20Ukg（略）表 3poINP 对糖尿病大鼠的降血糖作用（略） 3 讨论 我们利用改良的乳液聚合法制备的 INP，经 HPLC 检测，INP
